肿瘤间质成分在卵巢癌中的研究现状及进展

田宜畅， 张 颐

(中国医科大学附属第一医院妇科， 辽宁 沈阳 110001)

卵巢癌是种极为常见的妇科恶性肿瘤，在女性恶性肿瘤中，其死亡率首当其冲。据美国癌症统计数据显示，全美年均有约13940人因卵巢癌去世[1]。中国国家癌症中心的数据显示，中国年均有约2.5万人死因为卵巢癌，其致死率在女性恶性肿瘤中位列第10位(2015年)。由于卵巢癌早期不具备特异性的症状以及目前缺少可靠的卵巢癌筛查方法，约有70%的卵巢癌患者是在肿瘤转移到远处器官或腹腔时才被诊断出来的，从而导致患者进一步治疗更加困难[2]。大量研究表明肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)在癌症发展中起到了不可忽视的作用，TME中肿瘤间质中肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)、肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAMs)、内皮细胞、脂肪细胞、树突状细胞等成分同样会对卵巢癌的生长和转移造成影响。在未来研究中，肿瘤间质成分或会作为卵巢癌治疗的热门研究方向。

1 肿瘤相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)

CAFs是一类具有活性的成纤维细胞，通过刺激血管生成、ECM重构及细胞因子的分泌来增强肿瘤的侵袭性。目前普遍认为CAFs数量的增加与癌症晚期淋巴结高频转移及淋巴管、微血管密度增加相关，但腹膜环境中CAFs的确切来源仍不确定，常见的三种假说如下：①CAFs是由正常人成纤维细胞或骨髓源性间充质干细胞转化而来，在疾病的发展进程中分化并募集到肿瘤部位。②CAFs来源于间皮细胞，通过间皮向间充质转化(mesothelial-to-mesenchymal transition，MMT)转变为肌成纤维细胞。Rynne-Vidal等发现从腹膜转移性卵巢癌患者的腹水中分离出的间皮细胞可通过TGF-β-Smad介导的MMT程序诱导异种移植物生长，证实在EOC细胞和间皮细胞源性CAFs之间产生的TGF-β依赖性双向串扰可以促进生成更利于肿瘤转移的微环境[3]。③CAFs可能是由大网膜脂肪细胞去分化而来，但目前尚无文献证明在卵巢癌中CAFs与大网膜脂肪细胞的关系。Zhang等的研究调查通过抗α-SMA和抗成纤维细胞活化蛋白(anti-fibroblast activation protein，FAP)抗体定量CAFs、通过抗D2-40和抗CD34抗体评估病变淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)和微血管密度(microvessel density，MVD)，进而综合评估CAFs在EOC发展进程中作用。研究发现正常卵巢组织中未见α-SMA或FAP阳性的成纤维细胞，而卵巢癌中CAFs的数量高于交界性肿瘤和良性肿瘤中CAFs的数量[4]。此外，EOC细胞和CAFs之间的分子串扰还可能影响多种在肿瘤增殖和侵袭中起着至关重要的作用信号通路。综上所述，抑制CAF的激活可能是阻止EOC生长和转移的一种新型的有效策略。

2 肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages，TAMs)

TAMs是一种多功能的抗原呈递细胞，它可以通过与肿瘤实质细胞相互作用促进原核巨噬细胞的分化，进而参与肿瘤的免疫抑制、肿瘤侵袭与转移，在一定程度上影响肿瘤的进展。TAMs可以分为M1和M2两个亚型，其中M1型主要包括iNOS、CD86+、CD169+等，M2型(促癌型)主要包括CD163+、CD206+、CD204+等。此前科学界普遍认为上述两种类型均可能具有抗肿瘤活性，进而能够通过肿瘤相关免疫反应直接杀死肿瘤细胞。然而，近期研究发现只有M1型巨噬细胞具有抗肿瘤作用，M1也被称作抑癌型，可以通过吞噬肿瘤实质细胞，从而抑制肿瘤发展；M2型也被称作促癌型，具有促进肿瘤生长和转移，维持血管生成和间质重塑功能。在多种恶性肿瘤中，TAMs密度越高，临床预后越差，尤其是M2亚型为代表的TAMs[5]。

目前公认的卵巢癌转移的最常见部位为大网膜。Clark等的研究通过建造实验模型，对比了EOC细胞在含有乳斑的腹膜脂肪组织(如大网膜、脾门脂肪等)与乳斑缺陷脂肪组织(如子宫脂肪、肠系膜等)的定植情况，结果表明乳斑对EOC细胞向大网膜、腹膜脂肪的转移定植有显著的促进效应[6]。乳斑是由淋巴细胞和巨噬细胞等间充质细胞聚集而成，为了揭示这些细胞中哪一个是卵巢癌细胞定植的关键成分，Clark等将卵巢癌细胞注射到事先预处理好的缺乏各种免疫细胞的小鼠体内，结果表明缺乏T、B和/或自然杀伤细胞都不会影响卵巢癌细胞转移到大网膜的定植，而巨噬细胞的缺失可以显著抑制原发性肿瘤的发展和肿瘤的进展[7]。上述研究结果表明，巨噬细胞可能是乳状斑的主要成分，参与了原发性肿瘤的生长和网膜转移定植。

Robinson-Smith等的研究发现在大网膜微环境中，网膜乳斑处的血管系统CD105阳性，表明网膜乳斑处血管萌芽和血管生成活跃，进而推断出TAMs可以显著促进血管生成。与此同时，上述实验还发现在缺乏巨噬细胞的小鼠中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达下降[7]。因此，将TAMs和VEGF作为靶点可能是未来治疗卵巢癌的一种新型靶向治疗方法，靶向抑制TAMs可以抑制肿瘤血管生成及肿瘤相关炎症反应、靶向抑制VEGF可以抑制其导致血管的高渗透性和腹水的积聚。

3 内皮细胞

内皮细胞覆盖血管的管腔侧，形成引导血液流经全身的管道。因此，内皮细胞是肿瘤血行转移的一个重要因素。在实体瘤的发展过程中，癌细胞产生血管生成因子，诱导毛细血管内皮细胞增殖、迁移并形成新的血管网络，进而为肿瘤生长提供营养和氧气，促进肿瘤细胞向远处器官扩散。目前研究最多的血管生成因子是VEGF-A，它由肿瘤细胞和基质细胞分泌，并且可以与内皮细胞上的特异性受体VEGFR1和VEGFR2结合，促进血管的新生和血管通透性的加强。目前科研人员已研究出多种靶向血管生成因子药物及各种FGF抑制剂，如贝伐单抗等。

表达Tie2的单核细胞(Tie2 expressing monocytes,TEMs)是较新的一个研究方向。Wang等研究表明在血管生成素2(angiopoietin 2，Ang2)的刺激下，TEMs数量显著增加，并在EOC患者的血液和腹水样本与肿瘤细胞数成正相关[8]。在卵巢癌组织中，TEMs通过IGF1激活下游信号进而刺激内皮细胞，因此TEMs的增加与卵巢癌组织中的MVD呈正相关。抑制IGF1可减少TEM介导的血管生成，提示Ang2-TEMs-IGF1信号通路可能是EOC的一个有前途的治疗靶点。

Smad4是内皮细胞中参与TGF-β相关配体反应的关键因子，它的缺失可促进卵巢癌的转移[9]。Yang等的研究发现无论在体内体外，siRNA介导的Smad4缺乏均能减少血管内皮细胞微管的形成，破坏了内皮细胞屏障的完整性，增加了血管通透性，促进了卵巢癌细胞肝转移，但Smad4的缺乏并不影响体内肿瘤的生长[9]。研究还表明Smad4和Src激酶家族(Src family of kinases,SFK)中的FYN之间的负性相互调节可以增加内皮细胞的通透性。FYN的激活会导致细胞间连接的分离和粘附性的减弱，从而增加细胞旁的通透性。上述研究证实Smad4的缺乏在卵巢肿瘤细胞通过内皮屏障迁移和转化为侵袭性表型中起到了重要作用，Smad4也可以作为EOC患者靶向治疗的新靶点。

4 脂肪细胞

由于卵巢癌的主要转移部位是大网膜，80%的浆液性卵巢癌患者有大网膜转移。大网膜是一个覆盖肠道的脂肪结构，除了具有内分泌功能外，还是大量脂质的储存场所。到目前为止，关于大网膜为何是卵巢癌转移的主要部位还尚无定论。然而鉴于大网膜的一个重要而丰富的成分是脂肪细胞，目前推测脂肪细胞所分泌的一些脂肪因子，如NF-α、IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白1，可能在卵巢癌转移到大网膜的倾向中起关键作用。Nowicka等的研究发现大网膜来源的脂肪干细胞促进卵巢癌细胞的增殖和迁移，并促进卵巢癌细胞产生化疗耐药性[10]。在大网膜脂肪细胞重编程之后脂肪细胞能够刺激癌细胞中的一种脂肪酸转运体FABP4的表达，进而使得癌细胞能够吸收脂肪细胞中的脂肪酸并利用它们进行生长[11]。

5 树突状细胞

树突状细胞(dendritic cells，DCs)是为适应性免疫系统提供抗原和共刺激信号的抗原提呈细胞(antigen presenting cells，APCs)。在稳定状态下，DCs主要表现为不成熟的APCs，具有较高的抗原捕获和提呈能力，但协同刺激因子的表达量较低。但当DCs受到细菌、病毒、炎症或肿瘤抗原的刺激时，它们可以被激活，从而使得抗原捕获活性减弱，共刺激因子、主要组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ,MHC class Ⅱ)和C-C趋化因子受体7型(C-C chemokine receptor type 7,CCR7)的表达增加，增加淋巴的迁移率。因此癌症患者的树突状细胞可以通过诱导T细胞依赖的抗癌免疫来激活抗肿瘤反应。

在树突状细胞的不同亚群中，炎症性树突状细胞(inflammatory DCs，inf-DCs)是抗肿瘤反应的重要组成部分。inf-DCs在稳态条件下基本上不存在，在炎症或癌症刺激下直接来源于循环中高表达的Ly6C单核细胞。在卵巢癌中，树突状细胞中脂质的积累是导致抗原交叉呈递和抗肿瘤T细胞反应受损的一个重要机制。如前所述，网膜脂肪细胞为癌细胞增殖提供能量。Cubillos-Ruiz等的研究发现，脂质滴的积聚可以激活树突状细胞内质网(endoplasmic reticulum,ER)和内质网应激反应因子剪接X盒结合蛋白1(X-box-binding protein 1,XBP1)。由脂质过氧化副产物触发的XBP1激活刺激DCs的甘油三酯生物合成，导致脂质异常积聚和后续DCs的功能障碍[12]。该研究还发现发现DC特异性XBP1的缺失或沉默选择性纳米颗粒介导的XBP1可恢复其原位T细胞刺激能力并延长存活时间。因此，针对树突状细胞内质网应激反应卵巢癌的免疫治疗提供了一个新靶点。

6 细胞外基质(extracellular matrix)成分在EOC转移中的作用

6.1蛋白酶：尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase type plasminogen activator，uPA)是一组丝氨酸蛋白酶，它参与血栓溶解、伤口愈合和组织重塑等许多生理过程。目前有多项研究表明uPA及其抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂1型和2型(PAI-1和PAI-2)及其受体(uPAR和CD87)在肿瘤侵袭转移中起着重要作用，超过75%的原发性卵巢癌中uPA和PAI-1的过度表达与化疗耐药、肿瘤分期、分化程度及肿瘤的侵袭行为密切相关。uPA和PAI在卵巢癌细胞脱离、新基质形成、肿瘤细胞再植入和转移抑制中起到了重要作用，将来可以进一步研究其作为晚期EOC患者的维持治疗方法的可行性[13]。组织蛋白酶L(Cathepsin L，CL)和肝素酶(heparanase，Hpa)是参与ECM不同成分降解的基质水解酶，在许多正常细胞生理变化以及肿瘤发生中起着关键作用，CL与Hpa与EOC的侵袭和转移可能具有相关性，故CL与Hpa在未来可以作为生物标志物来评估EOC患者的恶性程度。

去整合素和金属蛋白酶(A disintegrin and metalloproteinases，ADAMs)同时具有粘附和蛋白水解的特性，能与整合素相互作用调节细胞的增殖、粘附和迁移，而与金属蛋白酶的活性无关。Ma等的研究表明，在EOC组织中ADAM23的mRNA和蛋白质水平显著低于相应的对照组织；在EOC患者中，ADAM23表达的缺失与肿瘤分期、淋巴结转移以及PFS和OS缩短有着显著的相关性。因此，ADAM23可以看做是EOC患者生存率的独立预测因子[14]。

天冬酰胺基内肽酶(asparaginyl endopeptidase，AEP)是肽酶C13家族的一员，对天冬酰胺键的断裂具有特异性，参与维持ECM稳定性。AEP在肿瘤细胞和正常细胞的ECM中均有表达，但在多种肿瘤细胞呈过度表达的状态。Zhu等的研究发现，AEP在EOC肿瘤细胞和腹水中均呈现高表达，且在体内外均能诱导EOC的生长和发展。因此，AEP可作为EOC肿瘤分级和FIGO分期的预测因子，但其在EOC发生发展中的作用尚需进一步研究[15]。泛素样小分子修饰因子(small ubiquitin-like modifier system，SUMO)特异性蛋白酶3介导上皮-间质转化的氧化还原敏感分子，也是EOC增殖和核糖体RNA加工的关键因子，在EOC中表达升高，并与肿瘤的分期、分级和转移有关，该蛋白酶可能是EOC的潜在的预后因子。

6.2其他ECM成分：钙黏蛋白(Cadherin)是一种钙离子依赖的同亲型结合细胞黏着糖蛋白，在细胞识别、迁移和组织分化等过程中具有重要作用。近年来诸多研究发现钙黏蛋白在宫颈癌的EMT过程中起到了重要作用，促进肿瘤的转移并影响预后，但目前钙黏蛋白在卵巢癌中的研究目前较少。Klymenko等在体外和异种移植裸鼠模型的实验中均发现，钙黏蛋白的表达与EOC细胞侵袭与转移呈异质性。在EOC的侵袭过程中，先是腹腔内播散的肿瘤细胞和腹水中的多细胞聚集物(multicellular aggregates，MCAs)粘附在腹膜上，并诱导腹膜间皮单层收缩，进而侵入富含胶原的皮下基质并增殖成大转移灶。研究同时发现，间充质N-钙粘蛋白表达(N-cadherin-expressing，Ncad+)细胞和MCAs比E-钙粘蛋白表达(E-cadherin-expressing，Ecad+)细胞在EOC侵袭过程中更重要[16]。

整联蛋白(Integrin)又称整合素，是一类异亲型细胞黏附分子，主要功能为介导细胞与基质间的粘附，同时用于联系细胞外部作用与细胞内部结构。在EOC肿瘤组织中，整合素α5、β2、β3和β6的表达明显降低[17]。不同整合素的异常表达可能增加EOC细胞的迁移能力和与MMPs相关的细胞侵袭能力，但其调控的分子机制还需进一步研究。

黏蛋白(Mucin)是一种高分子量，重糖基蛋白，通常由上皮组织产生，存在于ECM之中。黏蛋白既可以作为上皮细胞的保护屏障，也可以作为外部环境的传感器将信号传递给细胞。具有膜依赖性的黏蛋白表达的改变于肿瘤细胞的增殖和迁移具有相关性。MUC20过度表达与EOC 的预后不良具有相关性，同时MUC20还可以通过激活EGFR-STAT3通路增加EGF诱导的恶性表型EOC细胞增殖。

7 小 结

近年来人们对于EOC的认识有了很大的进展，除了研究EOC实质肿瘤细胞本身，越来越多的人将目光投向EOC侵袭转移的动态过程中。肿瘤间质成分则是该过程中不可缺少的重要部分。卵巢癌是妇科恶性肿瘤中最常见的一种，大部分患者确诊时已处于中晚期阶段，且目前尚无较好的治疗方法，使得卵巢癌的死亡率居高不下。研究各个肿瘤间质成分与肿瘤细胞之间的相互作用，可以更好的确定卵巢癌的分子治疗靶点，也是未来EOC研究的重要方向。