P-糖蛋白与宫颈癌顺铂化疗耐药关系及相关机制的研究进展

叶鑫鑫，王亚军 综述 周航 审校

遵义医科大学第二附属医院腹部肿瘤科，贵州 遵义 563000

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，也是最常见的女性肿瘤死亡原因之一。2018年对全球癌症进行的统计数据可见：宫颈癌是全球女性人群中发病率和死亡率排第二的肿瘤[1]。高危型人乳头瘤病毒(HPV)的感染是其主要的发病原因，它会引起妇女宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的发生。目前发达国家中宫颈癌的数量已较前明显减小，但在发展中国家，宫颈癌的数量仍在上升，死亡率也随之增加[2]。手术和放化疗一直是宫颈癌主要的治疗手段，早期患者主要以手术为主，中晚期患者大多通过放化疗治疗。晚期或复发转移性宫颈癌患者一般采用单纯化疗法，但因为化疗耐药现象越来越普遍，所以化疗药物的疗效和应用大打折扣，使得治疗效果不佳甚至失败，这类患者一年生存率仅为10%~20%[3]，所以宫颈癌化疗耐药的难题长期困扰着临床工作者们。

顺铂作为经典的宫颈癌化疗药物，于1845年首次被发现并制备出来，后对该药物的测试发现其对多种动物肿瘤均有效。宫颈癌的化疗建议采用单用顺铂或是含顺铂方案的联合化疗。但是，天然耐药和后天耐药都极大地削减了顺铂对肿瘤的治疗作用。顺铂抗肿瘤作用的分子机制主要为与作用细胞的DNA形成DNA-顺铂复合物，进而引起其作用细胞的DNA损伤。当顺铂诱导的DNA损伤无法修复时，细胞就会发生凋亡并死亡。其中P-糖蛋白(P-gp)在影响顺铂发挥抗肿瘤的作用过程中起着重要的作用，也是目前在顺铂耐药原因中研究的较多的一个蛋白分子。

1 P-gp简介

P-gp即P-糖蛋白，是由多药耐药基因1(MDR1)编码的首个人体ABC(ATP结合盒)转运蛋白，它属于依赖ATP的跨膜转运蛋白质。人体的P-gp氨基酸残基多达1 280个，有着170 kD的相对分子量[4]。它大量存在于身体的五脏六腑中，包括大脑、肾脏、睾丸、肾上腺素、肝脏、子宫、肠组织、卵巢、胎盘等正常人体器官内，身体中各种内、外源性物质的吸收、代谢和排泄都与之相关，对维持机体稳态有着关键意义。许多肿瘤中都存在它过表达的现象，比如常见的一些癌症，包括肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌和宫颈癌等，大量的研究表明P-gp与肿瘤的化疗耐药关系紧密。

高国兰等[5]基于免疫组化法对51个宫颈癌组织和9个正常宫颈组织进行了相应的检测，涉及其中的P-gp、GST-π和TS蛋白的表达区别，结果发现51个宫颈癌组织P-gp蛋白阳性表达率达到45.10%(23/45)。随后的曾四元等[6]对宫颈癌组织中P-gp、GST-π、Topo-Ⅱ的表达及意义探索时发现P-gp表达现象还存在于正常宫颈、宫颈上皮内瘤变(CIN)、初治宫颈癌和复发癌组织里，它们的表达强弱排序如下：正常宫颈组织最低，其次是CIN，初治宫颈癌又大一些，最高的是复发宫颈癌组织。P-gp低、高表达组三年生存率依次为93.3%和63.3%，随之做出如下猜想：P-gp表达上升不但会作用于宫颈癌的发生发展，也会对宫颈癌的预后产生影响。郭慈仁等[7]对P-gp、GST-π和TopoⅡ在巨块型宫颈癌中的表达和与新辅助化疗的关联一并进行了探索研究，并且得出了结论：P-gp不光在新辅助化疗组，在单纯手术组中也会有表达，这种现象猜测是肿瘤细胞天然耐药的证据，所以对于肿瘤细胞有原发性耐药现象的论述是赞同的。继而发现P-gp在新辅助化疗后的表达率和单纯手术组相比增高，这个发现证明化疗能够使得耐药分子发生表达转变，从而导致后天耐药，也就是获得性耐药。该团队还发现新辅助化疗组中P-gp表达阳性组的化疗有效率远远小于表达阴性组的有效率。以上发现表明，P-gp在宫颈正常组织和肿瘤组织中都普遍存在，但在肿瘤组织中的表达大于正常组织。因此P-gp的高表达是引起化疗耐药的关键因素。

2 P-gp介导的宫颈癌顺铂耐药机制

2.1 P-gp导致化疗药物的外排增加 既往已有大量研究表明，5"-三磷酸腺苷(ATP)结合盒(ABC)转运蛋白可能通过增加顺铂外排介导顺铂耐药，ATP结合盒转运蛋白包括多药耐药蛋白(MRP)一系列：MRP1、MRP2、MRP3和MRP5在内。MRP1过表达已被发现在一些宫颈癌细胞中与宫颈癌顺铂耐药相关联。下文所述研究表明，宫颈癌顺铂耐药株SiHaR中MRP1和P-gp1的过表达使宫颈癌细胞产生耐药性。比如姜黄素作为MRP1和P-gp1的抑制剂应用于耐顺铂的宫颈癌细胞中后，结果对比未加入姜黄素组显著减少了顺铂的化疗剂量，化疗药物对肿瘤细胞的敏感性得到了增强[8]。童文娟等[9]在P-gp对宫颈癌化疗耐药影响及耐药分子机制方面进行了研究，发现宫颈癌细胞在含依托泊苷的培养基中在较短时间内会导致细胞内依托泊苷药物含量上升，抑制或提升P-gp活性对细胞内药物含量不产生相关作用。表明P-gp对依托泊苷的摄入过程没有相关作用，而在持续培养细胞过程中，细胞内依托泊苷含量表现出了减小趋势，这个时候当P-gp活性再次被抑制时，此时细胞内的药物浓度恒定，证实P-gp参与依托泊苷的泵出过程。因此，他们的研究充分说明了P-gp导致化疗药物的外排增加。

2.2 P-gp参与凋亡抑制 P-gp介导的耐药性并不仅仅只有增加药物外排这一原因，这种蛋白也参与很多凋亡抑制的过程，尤其是通过抑制凋亡信号通路和或抑制凋亡信号因子，导致肿瘤细胞耐药。TAINTON等[10]进行了试验，发现突变过的P-gp不再具有泵出药物的活性，但对胱天蛋白酶(凋亡作用酶)的激活还存在着抑制作用，得到结论：P-gp耐药不是只靠其药物外排作用，在凋亡抑制中发挥影响亦是引起肿瘤细胞耐药的关键因素。还有一种发现是：P-gp在抑制胱天蛋白酶-3、激活胱天蛋白酶-8中有一定的效力，从而对细胞的凋亡产生抑制作用，进一步使得细胞耐药形成[11]。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是肿瘤坏死因子家族中的一员，可诱导多种肿瘤细胞凋亡。GALSKI等[12]研究表明，P-gp表达与TRAIL介导的凋亡相关，并且P-gp的活性是能够逆转TRAIL介导凋亡的关键，也证明了P-gp具有抗凋亡作用。Survivin蛋白是迄今发现的最强凋亡抑制因子，已有多种研究证实它在宫颈癌组织中高表达。WANG等[13]在对宫颈癌紫杉醇耐药株进行实验时发现，宫颈癌紫杉醇耐药株有着明显的耐药性，与亲本株相比，其P-gp和谷胱甘肽硫转移酶显著增加，与抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的高表达显著正相关，是肿瘤组织化疗失败的重要原因。于春霞等[14]研究了50例宫颈癌患者，得到结果：宫颈癌新辅助化疗后Survivin表达的阳性率(34.00%)相比于化疗前(78.00%)小许多。基于上述研究，陈芬等[15]通过制定P-gp、MRP1、Survivin在宫颈鳞癌新辅助化疗前后的表达差异和对临床疗效的预测作用研究中得出结果：化疗后Survivin的表达量显著低于化疗前水平，且新辅助化疗有效组Survivin的表达量显著低于化疗无效组，同时P-gp的表达水平与Survivin呈正相关。综上可见P-gp可通过抑制凋亡信号通路和或抑制凋亡信号因子发挥抗凋亡作用，进一步导致癌细胞对化疗药物耐药。

2.3 P-gp参与肿瘤细胞免疫调节功能 P-gp与肿瘤免疫细胞的表达、活化、表型转换和细胞因子释放有关。比如P-gp在外周血单核细胞中的表达很少，但在肿瘤浸润抗炎MΦ2组织巨噬细胞中的表达极高[16]。在所有天然免疫细胞中，自然杀伤(NK)细胞的P-gp表达水平最高，同时P-gp的表达调控了下游细胞毒性功能，对炎性毒性细胞分泌颗粒的形成和释放产生作用，直至调控靶细胞死亡。P-gp在适应性免疫调节细胞中的功能因细胞类型而异。在B细胞中，P-gp的表达与细胞迁移和淋巴结移行表型有关。在CD4+T细胞中，P-gp与炎性Th1/Th17效应细胞表型相关，而在抗炎Treg表型中表达极则很少[17]。目前已有很多研究发现，恶性血液系统疾病患者免疫细胞中的P-gp表达水平明显上升，比如多发性骨髓瘤、急性髓系白血病(AML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤在内的等等，所以这些肿瘤常常对化疗产生抗药性[18]。值得注意的是，以单克隆抗体(MAb)为基础的抗CD20和抗CD19的靶向治疗可以克服P-gp介导的化疗耐药性，有研究指出可能原因是因为MAb不能被P-gp排出胞外[19]。关于P-gp与细胞免疫对宫颈癌化疗耐药是否有确切的相关性尚没有特别的研究报道，但免疫细胞存在于每个人体内，与个体健康息息相关，所以P-gp参与肿瘤细胞免疫调节功能这一方面对于宫颈癌化疗耐药机制来说也是一个未来可研究的方向。

2.4 P-gp与非编码RNA 非编码RNA属于功能性RNA分子，不能翻译为蛋白质，对基因的转录翻译起着重要的调节作用，即不包括mRNA、tRNA和rRNA的其他RNA分子。这其中有一种微小RNA(microRNA，miRNA)，它能够调控体内多种基因的转录，还能对基因转录后mRNA的翻译过程产生抑制作用。MiRNA普遍存在于生物体内，其结合对应的靶基因mRNA 3"端非编码区(3"-UTR)后，能够降解靶基因的mRNA或抑制转录后的翻译过程。P-gp的表达可以受到miRNA的直接作用，也可因为某信号通路被miRNA所干扰影响P-gp的表达从而引发肿瘤细胞耐药。刘昀昀等[20]及其团队研究表明，增强宫颈癌Hela、Siha细胞株中miR100的表达水平对肿瘤细胞的侵袭活力有明显抑制作用，同时Hela、Siha宫颈癌细胞对顺铂的敏感性也随之增强。鲁燕飞等[21]及其团队也对宫颈癌组织中miR100的表达量和顺铂耐药的关系进行了研究，他们把宫颈癌组织分成两组，即顺铂敏感组和耐药组，分别检测两组宫颈癌组织中miR100表达量，发现miR100在顺铂敏感组宫颈癌组织中的表达量比顺铂耐药组高很多，此外，他们发现Nek2、P-gp、GSTGπ、TopoGⅡ在顺铂敏感的宫颈癌组织中的表达比顺铂耐药的宫颈癌组织小很多，且miR100表达水平相对于Nek2、P-gp、GSTGπ、TopoGⅡ的表达量呈负相关。由此得出结论：宫颈癌组织内miR100表达过低会引发多药耐药基因的表达上升进而使得肿瘤细胞耐药性升高。MAO等[22]在84例宫颈癌患者的宫颈癌组织及癌旁正常组织标本中检测LINC0051的表达，探讨长链非编码RNA(lncRNA)LINC00511在Hela/PTX(宫颈癌紫杉醇耐药细胞)增殖、凋亡以及对紫杉醇耐药过程中的作用。结果发现沉默LINC00511表达后，Hela/PTX中MRP1、P-gp、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表达降低，而Bax和Caspase-3凋亡酶的表达增加，此外，沉默LINC00511可以抑制细胞对紫杉醇的耐药性，且可以促进抗PTX细胞凋亡。抑制LINC00511的表达为化疗耐药宫颈癌患者提供了新的治疗靶点。

2.5 与调节P-gp有关的信号传导通路 信号传导通路连接着细胞外信号刺激因子与细胞内信号传输系统，在肿瘤多药耐药过程中有关键的影响，大量的信号传导通路在P-gp介导的多药耐药过程中有着不可磨灭的作用。对P-gp表达有关的信号通路研究具体有：NF-κB、MAPK、PI3、ERK1/2、COX-2、ROS、Wnt/β-catenin通路等。例如，王劲欧等[23]在ER和MDM2及ERK1/2信号通路与卵巢癌细胞耐受抵抗药物有无相关性的研究中证实，ERK1/2酶在卵巢癌耐药细胞中的活力非常高，是非耐药细胞的1.5倍，其中ERK1/2激酶活性和MDM2的表达都和P-gp的表达是正相关关系。而在有关宫颈癌耐药研究中，ZHAO等[24]发现，下调宫颈癌SiHa细胞中S100A9基因可显著提高SiHa细胞的凋亡率，从而提高其对顺铂的敏感性，其机制可能与Bcl-2、GST-π和LRP蛋白的表达及AKT/ERK-FOXO1-Nanog信号通路的改变有关。DUAN等[25]在宫颈癌SiHa顺铂耐药细胞中发现，PSAT1通过阻断PI3K/Akt信号通路抑制SiHa顺铂耐药细胞增殖和诱导细胞凋亡，从而降低SiHa顺铂耐药细胞细胞对顺铂的耐药性。刘昀昀等[26]发现，经过放疗诱导的耐放疗宫颈癌Hela、Siha细胞系中，经典Wnt通路分子下游基因C-Myc、Cyclin D1表达呈上升趋势，这就使得检测后发现这个细胞中ABCB1、ABCG2表达也有所增加。张彦等[27]随后进行的一项探索发现，硫利达嗪对Wnt通路的活性具有抑制作用，同时Hela/DDP(耐顺铂宫颈癌细胞)中耐药蛋白(P-gp和MRP1)也明显降低。总结两项研究，得出Wnt/β-catenin可能直接或间接的升高宫颈癌顺铂耐药细胞中的P-gp表达，从而使肿瘤细胞耐药。

3 展望

晚期或复发转移性宫颈癌的主要治疗方式仍然是化疗，主要是通过单用顺铂或含顺铂方案的联合化疗，但顺铂化疗的耐药性使得这部分患者总生存时间有很大的削减。本文综述了P-gp对宫颈癌化疗耐药的作用及相关机制的探索进展。针对P-gp导致的化疗耐药，已有大量研究正在尝试改善这一现状。其克服耐药的策略基本围绕以下这些方面来展开：(1)对能逆转耐药性的天然化合物的挖掘及现有化合物的结构进行改造使其对耐药分子的抑制性有更强的活力及特异性；(2)对现有抗肿瘤药物进行改造使其能多靶点攻击肿瘤细胞，降低其耐药的可能性；(3)将各种抗癌药物与一氧化氮供体组合使其药物不光有抗癌作用还能持续提供高浓度NO：因持续高浓度NO能通过多种机制延缓肿瘤的进展，并能诱导肿瘤细胞凋亡，抵抗耐药，抑制转移的发生[28]；(4)将各种抗癌药物与吖啶类衍生物结合克服药物耐药：既往研究证明吖啶类衍生物与抗肿瘤药物合用能显著提升使用抗癌药物后期的细胞毒性作用[29]；(5)将部分抗肿瘤药物糖基化：糖基化的抗癌药物有更强的细胞毒性同时其耐药性比未糖基化药物发生得更晚[30]；(6)通过现代生物信息技术预测耐药分子结构、分析其药代动力学、生物利用度等，攻击其结构上与肿瘤细胞的最佳结合位点，特异性降低耐药分子的活性。而以P-gp抑制剂为主的药物主要有以下四代：第一代有以下六种，包括一钙离子拮抗剂、二钙通道阻滞剂、三免疫抑制剂、四蛋白激酶C抑制剂、五抗生素和六表面活性剂等等。第一代中以维拉帕米、环孢菌素A作为经典药物代表。但第一代抑制剂对P-gp的亲和力低，毒性大，临床应用少之又少。通过对第一代抑制剂结构的改进，衍生了第二代抑制剂，如右维拉帕米、代司朴达和比立考达等药物，较之第一代，与P-gp亲和力更强、毒性小、效果更佳[31]。然而，由于其他ABC转运蛋白抑制剂和细胞色素P450酶抑制剂的大量应用，这些药物抑制剂与P-gp抑制剂之间药物靶点存在重叠，遂其药代动力学受到相互影响，限制了第二代的临床应用[32]。随着定量构效关系学(QSAR)及组合化学的发展，高选择性和更有效的第三代P-gp抑制剂产生了，主要有以下三种：一是苯甲酰亚胺衍生物、二是环丙基二苯丙环庚烷类物质、三是替代二芳基咪唑的衍生物等。第三代能特异性和P-gp结合导致其独特的药物外排作用损伤，使得细胞内化疗药物浓度提升，扭转多药耐药的发生。即使第三代抑制剂优于第一代和第二代药物，但在Ⅲ期临床试验中发现其仍存在有不同程度的毒性反应，且对患者的死亡率没有显著影响，所以第三代抑制剂的进一步发展也受到了限制[33]。这也就导致了第四代抑制剂被开发出来，包括：(1)从植物或自然环境中分离的化合物及其衍生物；(2)拟肽；(3)双配体(能够抑制P-gp和另一种MDR的化合物)[31]。还有酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)[34]、免疫抑制剂、类固醇衍生物、中药以及利用小分子RNA干扰P-gp的转录，从而抑制P-gp的过表达以阻断多药耐药现象等等，以及其他新型药物及技术正在不断被世界各地的学者所研究。当然，根据既往研究结果，笔者知道对于P-gp介导的宫颈癌顺铂耐药只是宫颈癌化疗耐药众多机制中的一个方面，不能只针对一种耐药机制做出克服策略，要知道，引起宫颈癌顺铂或多药耐药的机制非常复杂，代表各位临床科研工作者需协调多种因素共同调控。鉴于临床中宫颈癌顺铂和或其他药物多药耐药现象的发生越来越普遍，这个问题的解决变得迫在眉睫。研发新的基因治疗或药物治疗对于逆转肿瘤多药耐药意义重大，但同样重要的是确保肿瘤多药耐药抑制剂在临床治疗中的使用更安全有效。