探讨高效液相色谱法测定海水鱼中嘌呤含量

严玮桐

摘要：目的：探讨高效液相色谱法（HPLC）测定海水鱼中嘌呤含量的方法和效果。方法：选择新鲜的海鲈鱼、黄花鱼、鳕鱼3种海水鱼类，建立HPLC检测方案，优化色谱条件后测定样品不同部位的腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤含量。结果：4种嘌呤在0.1～400 mg/L的浓度范围内，具有良好的线性关系，相关系数均≥0.998，检出限在0.047～0.106 mg/L，RSD在0.021%～0.689%，平均回收率在94.289%～102.919%。不同海水鱼中的嘌呤含量差异明显，总嘌呤含量海鲈鱼>鳕鱼>黄花鱼;同一海水鱼不同部位的嘌呤含量差异明显，总体上鱼皮>内脏>鱼肉。结论：HPLC法测定海水鱼中嘌呤含量的精密度高、回收率好，是一种可行的检测方案。

关键词：海水鱼;嘌呤;HPLC;含量测定;精密度

To Study the Determination of Purine in Marine Fish by HPLC

YAN Weitong

（Food Sub Center of Jiujiang Inspection， Testing and Certification Center， Jiujiang 332000， China）

Abstract： Objective： To investigate the method and effect of high performance liquid chromatography （HPLC） for the determination of purine in marine fish. Methods： three kinds of fresh sea bass， yellow croaker and cod were selected to establish an HPLC detection scheme. After optimizing the chromatographic conditions， the contents of adenine， guanine， hypoxanthine and xanthine in different parts of the sample were determined. Results： The four purines had a good linear relationship in the concentration range of 0.1～400 mg/L， the correlation coefficient were all ≥0.998， the detection limit was 0.047～0.106 mg/L， the RSD was 0.021%～0.689%， and the average recovery was 94.289%～102.919%. The total purine content of sea bass>cod>yellow croaker; The purine content in different parts of fish in the same sea water was significantly different， in general， fish skin>viscera>fish meat. Conclusion： HPLC is a feasible method for the determination of purine in marine fish with high precision and good recovery.

Keywords： marine fish; purine; HPLC; content determination; precision

1 材料与方法

1.1 原料

本次试验所用的海水鱼，选择新鲜的海鲈鱼、黄花鱼、鳕鱼3种鱼类，均购置某水产市场。

1.2 仪器和试剂

电子天平、HPLC仪、pH计、紫外-可见分光光度计、超声清洗器、冷冻高速离心机、真空旋转蒸发仪、绞肉机、电热恒温水槽和超纯水系统等。

色谱级的腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤，纯度均>99%;色谱纯甲醇、四丁基氢氧化铵、冰乙酸、三氟乙酸;分析纯甲酸、高氯酸等。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

（1）流动相。参考曲欣[1]的研究，色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm;流动相：水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氢氧化铵，体积比：879∶100∶15∶6;柱温：30 ℃，流速：1 mL/min，进样量：10 μL，检测波长：254 nm。在此基础上进行优化，确定最佳流速和检测波长。

（2）流速。流动相确定后，选择3种流速分离嘌呤，分别是0.8 mL/min、1 mL/min、1.2 mL/min，对比确定最佳流速。结果显示：这3种流速均能在10 min内完成嘌呤的分离，其中0.8 mL/min分离效果最好，峰型最明显，因此确定最佳流速是0.8 mL/min。

（3）检测波长。配置嘌呤溶液，濃度为10 mg/L，然后进行全光谱扫描，设置范围在200～400 nm，从而确定适宜检测波长。结果显示：嘌呤溶液在200～300 nm有吸收峰，腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤的最大吸收波长分别是265 nm、271 nm、254 nm、278 nm。INAZAWA[2]的研究中，波长选择为260 nm;其他学者的研究中有254 nm、255 nm等[3-4]。本次试验分析，发现几种波长的检测结果没有明显差异，最终选择254 nm为检测波长。

经过优化，最终确定色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱，4.6 mm×250 mm，5 μm;流动相是水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氢氧化铵，体积比为879∶100∶15∶6;柱温30 ℃，流速为0.8 mL/min，检测波长为254 nm，进样量为10 μL。

1.3.2 样品处理

对海水鱼样品进行处理，目前已知方法有超声法、高氯酸法、混合酸法等。其中，超声法虽然操作简单，但嘌呤的提取率低。高氯酸法操作步骤复杂，等待时间长，容易生成氯气，会危害人身健康。混合酸法不仅对嘌呤的提取率高，而且甲酸对嘌呤具有保护作用。本研究最终采用混合酸法进行样品处理，混合酸的组成是：三氟乙酸和甲酸，两者的体积比是1∶1。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

配制单一标准储备液，浓度为1 600 mg/L，置于冰箱内在4 ℃恒温下保存。取等体积4种嘌呤的单一标准储备液，配制混合标准储备液，浓度为4 00 mg/L。然后加入超纯水稀释处理，配制出不同浓度的溶液，分别是200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、10 mg/L、5 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L和0.1 mg/L。这些溶液使用0.45 μm的微孔滤膜过滤，然后进行色谱分析，检出限是3倍信噪比对应的浓度。

根据优化后的色谱条件，检测混合标品中的嘌呤含量。以样品浓度作为X轴，以峰面积作为Y轴，进行线性回归分析，得出回归方程，并计算相关系数R，见表1。结果显示，这4种嘌呤在0.1～400 mg/L的浓度范围内，具有良好的线性关系，相关系数≥0.998，检出限在0.047～0.106 mg/L。

2.2 精密度

采用优化后的色谱条件，对300 mg/L的混合标品连续进样6次，根据每一次的测定结果，计算相对标准偏差（RSD），见表2。结果显示，6次进样测定值的RSD在0.021%～0.689，说明该方法的精度较高。

2.3 加标回收率

使用电子天平准确称量海鲈鱼的鱼肉样品2.4 g，平均分为12份，每份样品0.2 g。采用混合酸法进行处理，并根据优化后的色谱条件进行检测。按照嘌呤含量的0.5倍、1.2倍，分别加入嘌呤标准品，配制成不同浓度的样品，每个样品测定3次，计算回收率和RSD值，见表3。结果显示，4种嘌呤的平均回收率在94.289%～102.919%，说明该方法处理样品能减少嘌呤的损失量。

2.4 嘌呤含量测定结果

对3种海水鱼样品，分别选择鱼肉、鱼皮和内脏3个部位，按照1.3.2方法进行处理，采用优化后的色谱条件进行检测，得到4种嘌呤含量，并计算总嘌呤含量，见表4。分析可知：①不同海水鱼中的嘌呤含量差异明显，海鲈鱼的次黄嘌呤和黄嘌呤含量最高，黄花鱼的腺嘌呤含量最高，鳕鱼的鸟嘌呤含量最高，总嘌呤含量海鲈鱼>鳕鱼>黄花鱼;②同一海水鱼中，不同部位的嘌呤含量差异明显，内脏中的腺嘌呤和黄嘌呤含量最高，鱼皮中的鸟嘌呤含量最高，鱼肉中的次黄嘌呤含量最高，总体上鱼皮>内脏>鱼肉。

3 结论

HPLC技术具有高压、高速、高灵敏度、进样量少和环保的特点[5]。本次研究针对海鲈鱼、黄花鱼、鳕鱼3种海水鱼类，建立HPLC检测方案，优化色谱条件后测定样品不同部位的腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤含量，结论如下。

（1）选用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱，4.6 mm×250 mm，5 μm;以水-甲醇-冰乙酸-20%四丁基氢氧化铵为流动相，体积比为879∶100∶15∶6;柱温30 ℃，流速为0.8 mL/min，检测波长为254 nm。经试验证实，4种嘌呤在0.1～400 mg/L的浓度范围内，具有良好的线性关系，精密度较高，回收率良好。

（2）总嘌呤含量方面：海鲈鱼>鳕鱼>黄花鱼;不同部位方面：鱼皮>内脏>鱼肉。为避免人体内嘌呤含量增高，预防高尿酸血症和痛风，提示人们少食用海鲈鱼，合理食用鳕鱼、黄花鱼;优先食用鱼肉，减少鱼皮和内脏的摄入量。

参考文献

[1]曲欣，林洪，隋建新.高效液相色谱法测定食品中嘌呤含量[J].中国海洋大学学报（自然科学版），2014，44（12）：41-47.

[2]INAZAWA K，SATO A，KATO Y，et al.Determination and profiling of purines in foods by using HPLC and LC-MS[J].Nucleosides， Nucleotides and Nucleic Acids，2014，33（4/6）：439-444.

[3]呂兵兵，张进杰，储银，等.反相高效液相色谱法检测带鱼糜中的嘌呤含量[J].中国食品学报，2012，12（7）：192-198.

[4]郑丽婷，王瑞恒，乐虹雯，等.高效液相色谱法测定啤酒中嘌呤含量[J].现代食品，2021（15）：205-209.

[5]张敏敏.超高效液相色谱技术在食品安全检测中的应用研究进展[J].乳业科学与技术，2019，42（3）：51-56.