混合型痴呆的动物模型研究进展

汪贤竹 张 菁

浙江大学医学院附属邵逸夫医院药学部，浙江杭州 310016

混合性痴呆（mixed dementia，MxD）是指患者同时患有阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）和脑血管病（cerebrovascular disease，CVD），临床上既表现有神经退行性变，也存在脑血管性病理改变的疾病[1]。以上这两种病变既可单独导致痴呆的发生，也可以相互作用，影响痴呆的进程[2]。然而上述两种病变发挥协同作用的机制仍不清楚，因此，急需建立一种能有效模拟人类MxD发病及病理特点的动物模型。近年来关于MxD动物模型的研究日渐增多，并取得了一定进展，本文对MxD动物模型进行综述。

相较于血管性痴呆（vascular dementia，VaD），根据其病理特点，AD已发展出很多成熟的动物模型。神经细胞β-淀粉样前体细胞[myloid beta （A4） precursor protein，APP]由于变异，可在错误的位置经酶切后会形成淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ），成为AD的特征性病理改变[3]。利用基因工程的方法将人源性APP（野生或突变）基因导入小鼠中，使其过表达，就会引起Aβ沉积异常、tau蛋白异常磷酸化、脑淀粉样血管病、脑萎缩、神经元凋亡、认知缺陷和行为障碍等神经退行性改变症状[4]。目前APP转基因小鼠模型，如PDAPP、Tg2576、APP23、CRND8，均已广泛应用于AD的实验研究。而脑血管病变的模式动物可按模拟脑血管病的成因分为缺血型、高血压型、糖尿病型等类型。两种疾病模型的有机结合就形成了MxD的动物模型。

1 缺血-AD模型

1.1 慢性低灌注-AD模型

APP23小鼠是过表达人APP751突变基因（Swedish 2个点突变K670N、N671L）AD的模式动物[5]。对APP23小鼠行双侧颈总动脉结扎术，以逐步降低脑血流量来模拟脑血管病变的作用[6]。结果显示，与包括野生型假手术组小鼠以及APP23假手术组在内的对照组相比，低灌注-APP23组小鼠tau蛋白磷酸化和α-突触核蛋白磷酸化显著增高。表明缺血损伤促进了AD小鼠神经退行性病理特征。另外，低灌注-APP23组小鼠血管壁上MMP-9显著激活，表明该模型存在严重的血脑屏障损伤，神经血管重塑加剧。脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是 Neurotrophin家族的成员，在神经元生长和存活中起重要的作用，被认为和认知能力有关[7]。低灌注-APP23组小鼠血管内皮细胞中BDNF表达量显著降低。

综上，该模型操作简单，既模拟了MxD中血管病变的因素，也涉及了AD相关的病理改变，但该研究只关注了神经病理学上的变化，包括从BDNF上的间接体现，但缺点是未检测能直接体现认知功能变化的指标，如认知行为学的改变。

1.2 MCAO-AD模型

该模型的脑血管病变是通过在小鼠中进行远端大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）加缺氧构建。吸入异氟烷麻醉的小鼠，在颞肌处切开切口，在肌肉中创建了一个口袋以露出下面的头骨，并确定大脑中动脉的位置。使用微钻头来暴露下面的大脑中动脉。切开脑膜，并使用小血管烧灼器对血管进行烧灼。最后，使用手术胶封闭伤口。手术后立即将小鼠置于含有9%氧气和91%氮气的空间内45 min。除大脑中动脉烧灼外，假手术小鼠进行了相同的手术步骤，并且在手术后45 min内也接受了9%的氧气和91%的氮气处理。在整个手术和缺氧期间，所有小鼠体温均维持在37℃[8]。在缺氧的辅助作用下，能形成包括约25%的手术同侧脑半球面积的梗死。而另外一部分的AD模型采用的是hAPP-SL的转基因小鼠模型。除了认知行为障碍，老年性痴呆患者还大多伴随精神行为异常，包括焦虑、抑郁、冷漠、妄想和幻觉[9]。因此，此模型研究者还采用了水平爬梯，Y迷宫和新事物识别实验，光(暗)转变测试来分别测试小鼠的运动，认知以及焦虑状态。在术后4周，研究者发现，缺血都会加剧年长hAPP-SL小鼠的以上各种行为缺陷。且与假手术的hAPP-SL小鼠相比，缺血的hAPP-SL小鼠的丘脑白质区和内囊中的磷酸化的tau蛋白也显著增多。但是，与对侧半球相比，同侧脑区的磷酸化的tau蛋白的面积无差异，表明MCAO损伤以全脑损伤的模式加剧了缺血对hAPP-SL小鼠中与AD相关的病理学。另外，研究人员在手术后12周对同侧脑区匀浆中的Aβ42进行了定量检测。与假手术组相比，MCAO组的同侧皮质白质（包括丘脑和内囊）中可溶性Aβ42的水平明显更高。因此，缺血可能通过增强的tau和Aβ42加剧了hAPP-SL小鼠的神经变性。

综上，不同于传统的颈内线栓法制备的MCAO模型可能造成的高死亡率[10]，该模型的优点是较稳定，并且术后小鼠能长期存活，可以模拟MxD的多个特征，但缺点是手术较为复杂，较为费时。

1.3 局灶性皮质下缺血性中风-AD模型

ApoE4-TR：5XFAD转基因小鼠是5XFAD[APP K670N/M671L（瑞典）+I716V（佛罗里达）+V717I（伦敦）家族性阿尔茨海默氏病（FAD）突变]与突变的人早老素1（PSEN1）的杂交体，其中插入了M146L+L286V FAD突变，通过人载脂蛋白E4（APOE 4）敲入小鼠系[11]。APOE 4是AD的主要遗传风险因子，促进Aβ生成[12]。在发生重大AD病理之前，Hayden等[13]在2月龄小鼠左脑半球内进行皮质下白质中风或假手术。诱发中风后，在第7、10、15和20周进行新事物识别和24 h恐惧调节实验；在5月龄时测量脑代谢以及组织病理学。局灶性皮质下缺血性中风模型是通过在左脑前肢运动皮层下方立体定位注射不可逆eNOS抑制剂-N5-亚氨基乙基-1-鸟氨酸[L-N5-（1-iminoethyl）ornithine，L-NIO]完成[13]。与假手术组动物相比，中风的E4-TR：5XFAD小鼠的皮质区域中的淀粉样斑块负担显著减少，认知能力得到了改善。且位于皮层下区域中的激活的小胶质细胞的数量和形态复杂性增加，表明活化的小胶质细胞和皮质神经元之间的相互作用可能促进了淀粉样蛋白清除。由于这种皮层下白质缺血模型可以在脑白质中精确地产生局灶性中风损伤，引起局灶性炎症反应，并导致局部轴突和少突胶质细胞的损失[14]。

皮层下缺血性血管性痴呆是血管性痴呆最常见的亚型，其主要的病理表现为腔隙性脑梗死和脑白质病变[15]。那么，该模型仅损伤皮层下白质轴突，同时允许研究损伤的皮层下部位对与之连接的皮层部位神经元的影响，可能更符合临床上的实际需求。且该模型采用的5XFAD转基因小鼠模型，有较强但暂时延迟的淀粉样蛋白积累速率。使用这种范式，可以研究在hApoE4-TR：5XFAD小鼠发生严重淀粉样变性之前，皮层下白质缺血性痴呆的引入如何改变淀粉样病变的产生、皮质炎症、运动恢复和认知障碍。

2 高血压-AD模型

根据流行病学研究显示，MxD的主要血管危险因素是年龄、高血压、高同型半胱氨酸血症，以及白质高信号[16-17]。为了探索AD与慢性高血压之间的协同作用，Denver等[18]开发了高血压-AD大鼠模型，该模型是通过将APPswe/PS1ΔE9转基因小鼠与易发中风的高血压大鼠（stroke-prone spontaneously hypertensive，SHRSP）杂交产生的。首先，通过对血压的监测，表明高血压倾向是保留在SHRSP/AD交叉中。然后对组织的血管神经，炎症和AD病理进行评估。结果显示，SHRSP增加了AD依赖性神经炎症，表现为小胶质细胞和星形胶质细胞激活和tau病理增多，但斑块病理变化却出人意料，表现为更少的斑块和紧实的核斑，表明斑块负担减轻。血管病理学证据包括星形细胞尾足蛋白aquaporin-4分布异常，正常情况下分布在微血管中，但在SHRSP/AD大鼠中，aquaporin-4大部分与血管分离，表现为无组织或重新分布于神经纤维中。脑小血管样疾病病理的其他证据包括脑血管胶原Ⅳ染色增加和血小板内皮细胞黏附分子-1水平升高。胱天蛋白酶切割的肌动蛋白增加，髓磷脂的损失和神经元中钙结合蛋白染色的减少。此外，SHRSP/AD存在线粒体缺陷，特别是复合物Ⅱ的丧失，伴随着AD依赖的线粒体复合物Ⅰ的丧失，都表明了SHRSP/AD大鼠神经元受损。但在新事物识别实验中，只有AD组表现出识别指数的下降；且在Y迷宫试验中，也只有AD组表现出进入正确臂次数下降，而SHRSP/AD组尽管进入正确臂次数下降，但无统计学差异。因此行为学数据却表明引入SHRSP表型并不会加剧FAD大鼠表现出的认知缺陷。

综上，此模型是基于MxD的危险因素高血压而做的尝试，难点在于转基因动物的杂交培养。

3 糖尿病-AD模型

尽管潜在的机制还尚不清楚，但已知中年肥胖症和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）可能会增加AD的风险[19]。以此为契机，Niedowicz等[20]创建了一个新颖的小鼠模型，该模型通过将病态肥胖和糖尿病 db/db 小鼠与 APPΔNL/ΔNLx PS1P264L/P264L敲入小鼠杂交来囊括T2DM和AD的特征。杂交后的小鼠（db/AD）保留了亲本系的许多病理特征，如极端肥胖、糖尿病和Aβ的沉积。两种疾病的结合也导致了其他病理，其中最引人注目的是严重的脑血管病理，包括动脉瘤和中风。尽管早老素的总体表达升高，但糖尿病小鼠的皮质部位Aβ沉积并未显著增加。令人惊讶的是，Aβ没有沉积在脉管系统中，也没有移至血浆中，并且没有刺激主要Aβ清除酶（中性溶酶，胰岛素降解酶或内皮素转化酶）的活化或表达。与db/db或APPΔNLx PS1P264L小鼠相比，db/AD小鼠在Morris水迷宫中显示出更明显的认知功能障碍。研究者认为这些小鼠的糖尿病和（或）肥胖症会导致脉管系统不稳定，导致中风，进而导致严重的认知障碍，且这些变化不是直接影响Aβ沉积导致的。

与高血压-AD模型相似，这种MxD模型基于另一高危因素糖尿病。为研究与肥胖相关的痴呆风险的潜在机制提供了新途径。同样双杂交动物对研究成本的要求上提出更高要求。

4 讨论

AD和VaD占痴呆症诊断的80%以上。尸检时，约有50%的痴呆患者表现出混合病理特征，即慢性脑血管疾病和AD病理的特征[21]。VaD最常见的神经病理特征是皮层下白质中的局灶性微血管缺血性中风病灶，与AD相似，这些病灶随时间累积，是进行性损伤的[22]。因此，AD与VaD这些与年龄相关的损伤具有共同的性质，为了理解这两种病理在神经生物学水平上如何相互作用，关键是使用能够准确反映最常观察到的病理学的方法进行充分建模。

MxD基于各种的模型研究，渐渐提出了几种假说来建立脑血管病理学和AD之间的联系，包括由白质损伤引起的轻度慢性炎症，导致脑血管清除Aβ的能力受损[23]，以及由APP触发的轴突分子死亡途径[24]，最终导致认知功能损伤。众所周知，心血管疾病增加了AD和MxD的风险，但是如何影响痴呆进展仍然难以捉摸。如在局灶性皮质下缺血性中风-AD模型中，皮质下白质中风反而减少了皮层病灶的淀粉样斑块积聚。而在高血压-AD模型中，行为学数据却表明引入脑血管病并不会加剧AD大鼠的认知缺陷。且也有研究发现，具有AD病理特征和脑血管病理特征的受试者损伤较少，认知功能下降较慢[25]，以上研究使这些协同损伤作用必然加重认知损伤的简单解释变得尤为复杂。这些看似自相矛盾的结果表明，混合病理必然导致淀粉样蛋白生成加速，进而导致痴呆的普遍假设可能并不完全正确，值得在动物模型中进行更多研究。