短期严重大气及细颗粒物污染对大鼠眼后段炎性因子表达的影响

石圆圆，王 欣，罗 灵，许倩倩，司少艳，聂 闯，石 琳，秦亚亚，宫玉波

战略支援部队特色医学中心，北京 100101 1 眼科；2 国家环境保护环境感官应激与健康重点实验室；3 特种医学实验研究中心

近年来我国雾霾天气频发，大气污染日益严重。国际癌症研究机构于2013 年10 月将室外大气污染列为人类致癌因素之一[1]。2012 年底，著名医学杂志《柳叶刀》发表的最新全球疾病负担研究结果表明，细颗粒物(PM2.5) 污染在健康危险因素中排名第5( 前4 名分别是高血压、吸烟、高盐饮食和不良饮食习惯)[2]。国内外多项流行病学研究表明，大气污染与呼吸道症状增加、肺功能降低、哮喘加重、心血管系统紊乱以及居民提前死亡有关[3-5]。大气污染及PM2.5 对眼部也有不良影响，如导致结膜炎及眼底血管管径改变[6]。但尚无大气污染与眼底炎性因子相关性的研究。2016年 12 月 16 日 20 ：00- 12 月 21 日 24 ：00， 北 京市空气重污染应急指挥部启动了空气重污染红色预警措施。本实验收集该时期的大气，将实验组大鼠暴露于该环境下，或暴露于该环境下并滤除空气动力学直径＞2.5μm 颗粒，检测大鼠眼后段的炎性因子表达情况，以探讨短期重度污染大气对眼后段有无急性影响。鼠无意外死亡情况。

表1 暴露期间空气质量数据(μg/m2)Tab. 1 Air quality data during exposure (μg/m2)

材料与方法

1 实验动物与分组 选取36 只体质量(200±10) g的健康雌性SPF 级SD 大鼠( 购自北京兴隆动物厂)。将SD 大鼠随机分为3 组，每组12 只，根据不同的暴露方法，分别为正常对照组、大气污染组和细颗粒大气污染组。实验动物的使用和饲养符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。

2 暴露方法 采用暴露饲养舱进行本次实验，两组暴露舱均实时收集外界环境中的大气。一组暴露舱无滤膜滤过，其内成分与外界大气完全相同，即大气污染组；另一组为暴露舱滤过去除空气动力学直径＞2.5μm 的物质，其内保留PM2.5 及气体污染物，即细颗粒大气污染组。正常对照组大鼠不做任何暴露处理并在原SPF 级环境中常规饲养相同时间。两个实验组大鼠的共同暴露时间为北京市雾霾红色预警时期(2016 年12 月16 日中午-22 日晨)，暴露期间空气质量状况如表1所示，全部数据来自国家环境监测总站。此期间空气污染最高达6 级，首要污染物为细颗粒物(PM2.5)，气体污染物以NO2、SO2为主。此期间各组大鼠摄食、饮水等生理活动不受干扰，且实验过程中所有大

3 取材 于 12 月 22 日 8 ：00 终止暴露。3 组大鼠均行眼球取材。主要步骤：按0.4 ml/100 g 行腹腔注射水合氯醛。每组中6 只大鼠以PBS(0.01 mol/L，pH 7.2 ～ 7.3，美国Gibco) 经心脏灌洗后，断头处死大鼠，摘除眼球，-80℃保存。取每只大鼠的右眼进行蛋白浓度测定。左眼用4% 多聚甲醛固定，进行形态学观察。每组其余6 只大鼠经腹主动脉取全血，于离心机中( 美国Beckman)，4℃下，2 000 r/min 离心20 min 后，取上部血清，-80℃保存。

4 提取眼后段蛋白及BCA 测定总蛋白浓度 仔细剔除眼球表面的肌肉及筋膜组织，于角巩膜缘处剪除角膜，去除晶状体及玻璃体，制作成眼杯。将眼杯按照裂解液试剂盒( 北京雷根生物) 说明提取蛋白。主要步骤：将眼杯用300μl 裂解液于1.5 ml EP 管中匀浆裂解，其后加入200μl 裂解液，冰上静置10 min。置离心机中( 美国Beckman)，于4℃下，15 000 r/min 离心15 min 后，取上清。按照BCA 试剂盒( 北京雷根生物) 方法，制备标准曲线。将上述上清液稀释2 倍后加入96 孔板中，各孔加入BCA 工作液后，37℃下温浴30 min。用酶标仪( 美国Bio-Rad) 测定各样品孔在540 nm 处的吸光度，根据标准曲线计算各孔蛋白浓度。各吸光度值根据标准曲线计算蛋白浓度值。将各样本上清液分别按照样本中最低蛋白浓度值稀释，将稀释为同一浓度的样本进行多因子芯片分析。

5 多因子芯片分析 将眼后段蛋白液样本按照Milliplex 多因子检测试剂盒( 德国默克公司，货号：PECYTMAG-65K) 操作流程进行制备，利用多功能液态芯片系统( 德国默克公司) 对眼后段蛋白液样本检测 IL-1β、IL-5、IL-18 及 MCP-1 的蛋白浓度。

6 血清IL-1β 测定 将血清标本按照试剂盒( 武汉优尔生科技股份有限公司) 说明书进行，采用酶标仪( 美国Bio-Rad) 于450 nm 波长下测定吸光度值，计算样本浓度。每样本复孔数为2，每孔重复检测3 次，结果取均值。

7 组织形态学观察 苏木精-伊红染色观察，主要步骤：固定于4% 多聚甲醛溶液中的组织24 h后行脱水、石蜡包埋，制成5μm 石蜡切片。石蜡切片置70℃烤箱烘烤后放入3 缸二甲苯溶液中进行脱蜡，各8 min ；之后依次放入梯度乙醇溶液中进行水化，各2 min，后流水冲洗；切片置于苏木精染色2 ～ 3 min 后流水冲洗，于盐酸乙醇溶液中4 s 后流水冲洗，再置于氨水中4 s 后流水冲洗，置于伊红溶液中1 min 后流水冲洗；再依次放入梯度乙醇溶液中各2 min，二甲苯溶液中10 min ；切片风干后以中性树脂胶封片，在倒置显微镜下( 重庆奥特) 观察、拍照。

8 统计学分析 使用SPSS23.0进行研究资料分析。观测资料中的计量数据，正态资料以-x±s表示，多组间比较为单因素方差分析+ 两两比较LSD-t检验。偏态资料以中位数Md(IQR) 描述，多组间的比较为Kruskal-Wallis 秩和检验。统计推断的检验水准α=0.05。

结 果

1 三组炎性因子水平比较 三组间蛋白中炎性因子比较发现，IL-1β 浓度差异有统计学意义(P＜0.05)，IL-5、IL-18 和 MCP-1 浓度差异无统计学意义(P＞0.05)。组间两两比较发现，大气污染组和细颗粒大气污染组IL-1β 浓度高于对照组(P＜0.05)，细颗粒大气污染组IL-1β 浓度高于大气污染组(P＜0.05)。见表2。

2 三组血清IL-1β 浓度比较 对照组、大气污染组及细颗粒大气污染组血清IL-1β 浓度分别为(69.26±19.93) pg/ml、(61.08±16.92) pg/ml、(64.34±21.42) pg/ml。三组差异无统计学意义(F=0.336，P=0.719)。见图 1。

3 三组眼后段组织病理学表现 眼后段切片行HE染色检查显示，各组视网膜各层次未见明显结构破坏或明显炎症细胞浸润。见图2。

图 1 三组血清IL-1β浓度比较(组间差异无统计学意义)Fig. 1 Comparison of serum IL-1β concentration among the three groups (There was no statistically significant difference between these groups)

表2 三组眼后段炎性因子水平比较 [Md(IQR)]Tab. 2 Comparison of levels of inflammatory factors in the posterior segments in the three groups (pg/ml, Md[IQR])

图 2 各组大鼠眼后节组织病理学检查(各组视网膜各层次未见明显结构破坏或炎症细胞浸润， HE×100)A：对照组； B：大气污染组； C：细颗粒大气污染组Fig. 2 Histopathological examination of the posterior segment of the rat eyes in each group (The posterior segment of the exposed eyes had no significant difference with the control group in pathological examination)A: control group; B: air pollution group; C: PM2.5 group

讨 论

大量流行病学研究表明，大气污染及PM2.5可引起机体呼吸系统、心血管系统和免疫系统疾病[3-5]。且损伤机制多种，包括炎症反应、氧化应激、免疫损伤、细胞自噬和凋亡等[5]。普遍认为呼吸系统的炎症是损伤的基本机制，PM2.5 成分会诱发促炎因子。Xu 等[7]将小鼠巨噬细胞暴露于北京提取的PM2.5 样本，发现有不同程度的氧化应激和炎症反应，其中IL-1β 增高，且与TLR4/NF-κB 通路和NLRP3 炎症小体激活有关。周园等[8]采集大气中可吸入颗粒PM10，并制备混悬液注入气管，检测肺泡灌洗液，发现IL-1、IL-8、IFN-γ 等促炎因子均不同程度升高。范欣等[9]发现实时细颗粒及大气污染条件下，大鼠气道除病理改变外亦存在IL-1 因子的上调。

大气污染及PM2.5 对眼部影响的研究主要集中于眼表。多篇文献提示其可引起非特异结膜炎和过敏性结膜炎[6]。2012 年Chang 等[10]报道空气污染与台湾地区非特异性结膜炎门诊病人数量呈正相关，与空气中 NO2、SO2、O3、PM10 增加相关。日本的一项流行病学调查发现PM2.5 在非花粉季节可增加过敏性结膜患病率[11]。Hong 等[12]通过回顾性研究发现环境中高水平NO2、O3增加了过敏性结膜炎的门诊就诊率。Gao 等[13]研究发现，PM2.5 可通过促进氧自由基的生成而导致角膜上皮细胞DNA 损伤，促进细胞衰老。另一项研究发现煤尘颗粒可促使结膜TNF-α 生物学活性升高和结膜上皮NF-κB 的高表达[14]。

大气污染对眼后段影响的研究极少，目前已有的研究集中于对视网膜血管影响的观察。Rozanova等[6]对66 篇相关文献进行了综述，显示慢性长期暴露于CS2，可导致视网膜静脉扩张；CO 可造成动静脉直径、视网膜血流速度以及眼底血管搏动幅度增加。Provost 等[15]对221 名儿童共进行了489次视网膜血管检查，测量学校、住所及附近主要道路PM2.5 暴露量，使用混合模型估算与近期和长期暴露相关的视网膜血管直径变化，同时调整其他已知的协变量，如性别、年龄、体质量指数、血压和出生体质量；测得暴露于PM2.5 浓度每增加10μg/m3，则分别对应着 0.35μm(95% CI ：0.09 ～0.61μm) 较窄的视网膜小动脉和 0.35μm(-0.03 ～0.73μm) 较宽的小静脉；距离主干道路每近100 m，小动脉变窄 0.30μm(0.05 ～ 0.54μm) ；由此认为环境污染可能通过微循环改变对儿童视网膜血管产生影响，会促进年龄相关性疾病的发展。另一项实验研究了空气污染水平的短期变化与视网膜微脉管系统变化之间的关系，发现视网膜中央小动/静脉直径当量与PM10 和黑炭浓度相关，在视网膜检查前24 h 内，平均PM10 每增加10μg/m3，其中央小动脉直径当量降低0.93μm，小静脉降低0.86μm ；黑炭浓度每增加1μg/m3都会导致视网膜中央小动脉直径当量下降1.84μm[16]。

大气污染是否会引起眼后段的炎症反应国内外尚无相关研究。本实验观察了经过6 d 重度污染后炎性因子在大鼠眼后段的表达量，结果显示IL-1β 显著升高。而文献显示IL-1β 可影响血管的通透性，亦可能引起血管平滑肌的收缩[17-19]。我们推测文献所观察到的大气污染所致的眼底视网膜血管改变有可能与IL-1β 升高有一定关系。

IL-1β 升高见于多种眼底疾病。如在糖尿病的视网膜血管中IL-1β 显著升高，与糖尿病神经炎症有密切关系。进一步研究显示IL-1β 在血管内皮细胞表达，而非视网膜中的小胶质细胞或星形胶质细胞等炎症细胞中表达[20]。严重的增殖性糖尿病视网膜病变患者中玻璃体液中IL-1β 明显升高[21]。抑制IL-1β 表达可预防和稳定糖尿病视网膜病变[22]。Il-1β 升高亦存在于年龄相关性黄斑变性疾病中，主要表达于视网膜色素上皮细胞中[23]。在年龄相关性黄斑变性及息肉状脉络膜血管病变患者的玻璃体液中IL-1β 升高5 ～ 10 倍，并可能与光感受器的变性和新生血管形成有关[24]。已知IL-1β 是一个多功能的促炎因子，有广泛的生物活性，除了其自身的炎症作用，还有信号放大级联作用，促进其他炎性因子如IL-6、IL-18和TNF-α 的产生，从而加强放大炎症反应[7,20]。因此我们应进一步关注污染大气及PM2.5 引起眼底IL-1β 改变的量效关系，并且长期高水平的IL-1β 是否可能引起有临床意义的眼底改变。

污染大气是通过何种途径引起眼底IL-1β 的改变，涉及何种机制，需要进一步研究。我们已知PM2.5 通过氧化应激反应增加心血管死亡事件，暴露于PM2.5 可引起血管内皮的损害[25-26]。既往有文献通过观察眼底血流的变化，推测空气污染的复杂成分可能减少眼底血流，对视网膜色素上皮细胞产生毒性，或在眼部通过氧化应激作用产生影响[6]。此外空气污染亦可引起全身的炎症反应，如CRP 的升高等[27]；不能除外全身反应可能会影响局部的炎性因子水平。因此我们在取眼球标本时采用PBS 心脏灌洗，以去除全身血液的影响。此外我们进一步检测了血清中IL-1β 水平，结果显示接触污染后并未见明显升高。本实验中未观察到炎症细胞的明显浸润增多，推测IL-1β 可能来源于眼底视网膜、脉络膜中固有的各种细胞，如视网膜色素上皮细胞、小胶质细胞、Müller 细胞以及血管内皮细胞，需进一步进行体内或体外实验。

本实验同时观察了IL-5、IL-18 和MCP-1 表达的变化，但组间并无明显差异。其中IL-5 与嗜酸性粒细胞及过敏性反应有密切关系[28-29]。IL-18亦为重要的促炎因子，并能够加强炎症细胞的细胞毒性作用[30]，MCP-1 为单核巨噬细胞趋化因子。这与我们观察到的眼底无明显炎症细胞浸润相符。但同时也应考虑到，本实验并没有对暴露后各时间点进行检测，并且实验动物数量偏少。

此外，本实验中滤除大颗粒的大气污染组IL-1β 亦明显升高，提示本实验中污染空气中引起眼底改变的可能主要是PM2.5 和各种污染气体。但同时我们也注意到与大气污染组相比，滤除大颗粒的暴露组的IL-1β 升高更加明显，这一改变尚需要我们扩大样本量进一步研究。

综上，本实验观察了SD 大鼠暴露于连续6 d北京的重污染天气后，眼后段组织中IL-1β 表达升高，滤除大颗粒仍显示IL-1β 表达升高；而对照组IL-5、IL-18、MCP-1 均无显著升高或降低，提示短期严重空气污染可能引起眼底的炎症反应，尚需进一步研究这一反应的量效及时空关系。