鲜茵陈提取物对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的作用

袁满，张君利，傅风华，吕剑涛*

(1.烟台大学药学院，山东 烟台 264005；2.滨州医学院烟台附属医院，山东 烟台 264005)

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是原发性肝癌中的一种，根据流行病学显示，肝细胞癌占原发性肝癌比例约为85%～90%。据以往的研究表明[1-2]，肝细胞肝癌在亚洲的发病率和病死率都很高，严重威胁着人类的健康[3-4]。

由于肝癌缺乏典型的早期临床表现而且恶性转化的程度较高，大部分的肝癌患者确诊时已经出现了侵袭或转移，肿瘤侵袭或转移是导致肝癌患者死亡的重要原因，因此肝癌的病死率较高。

目前治疗肝癌的方法主要有手术切除、肝移植和放化疗法[5-8]，其中手术治疗是主要手段，化疗是辅助手段，但术后极易复发转移，而且容易出现感染，大部分的化疗药物对肝癌的敏感性差，且全身的毒副作用大，因此肝癌患者的5年生存率一般不超过50%。

中医学认为肝是主宣泄，主藏血，有调节精神情志，以促消化吸收，维持气血、津液运行的功能。茵陈来自菊科植物茵陈蒿(ArtemisiacapillarisThunb.)或滨蒿(ArtemisiascopariaWaldst.et Kit.)的干燥地上部分，是中医常用保肝利胆药。有研究表明[9]，茵陈蒿能够降低黄曲霉素B1所诱发的染色体变异和基因突变，洪振丰等研究[10]表明茵陈蒿水煎剂可以下调实验性的食道肿瘤大鼠肿瘤组织的cdk2和p53表达。另外，也有学者研究发现茵陈具有一定的抗肿瘤活性，蒋幼凡等[11]发现茵陈蒿的提取物茵陈素能够抑制肺癌细胞增殖，引起细胞周期的阻滞，诱导细胞出现凋亡的特征，茵陈提取物对其他多种肿瘤也具有抑制作用，包括肾癌[12]、鼻咽癌[13]等，茵陈提取物茵陈色原酮能够抑制乳腺癌的侵袭[14]。综上，茵陈具有抗肿瘤作用，但对于茵陈抗肝癌作用的研究相对较少，因此笔者对鲜茵陈提取物对肝癌细胞HepG2细胞的作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

鲜茵陈提取物由滨州医学院烟台附属医院提供。氟尿嘧啶注射液(5-FU，批号：FA171116，旭东海普)；MEM(批号：0050819，BI)；胎牛血清FBS(批号：42Q1670K，Gibco)；四氮甲唑蓝(MTT，北京索莱宝公司)；二甲亚砜(DMSO，批号：1121E036，北京索莱宝公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，上海伦诺生物医药技术有限公司)；Annexin V-FITC/PI 试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；HepG2细胞株(中国科学院细胞库)。

1.2 试剂的配制

1.2.1 茵陈提取物溶液的配制

用培养基稀释提取物至所需浓度。阳性对照组为5-FU用培养基稀释至所需浓度。对照组为含10%FBS的MEM培养液。

1.2.2 PBS的配制

将PBS粉末溶于去离子制成浓度为0.01 mol/L溶液。

1.2.3 MTT的配制

用0.01 mol/L PBS溶液配制成5 mg/mL浓度，4 ℃避光保存。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

人肝癌HepG2细胞株购于中国科学院细胞库，用BI公司的MEM培养基，添加10%FBS和1%双抗培养细胞，将细胞置于37 ℃的加湿培养箱中，并在5% CO2环境中进行培养。

1.3.2 MTT实验

将对数期生长的HepG2细胞用胰酶消化，使用EMEM培养基稀释，将100 μL(5×103个/孔)的细胞悬液接种于96孔板，培养24 h后，添加5-FU(阳性药)和鲜茵陈提取物，使其终浓度分别为1 000 μg/mL和0.05、0.10、0.15、0.20、0.40 mg/mL，每个浓度增加5个副孔，对照孔加等量细胞和培养液。在37 ℃，5% CO2的培养箱中培养24 h或48 h，加MTT(5 mg/mL)20 μL/孔，继续培养4 h，吸弃上清，加DMSO 150 μL/孔，摇床振荡10 min，酶标仪490 nm波长下检测个吸光度(A)。按照如下公式计算：

抑制率(%)=(1-实验组A均数/对照组A均数)×100%

1.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

将处于对数生长期的人肝癌HepG2细胞以1×105/孔的密度接种于6孔板上，培养24 h后加入不同浓度的鲜茵陈提取物(0.025、0.05、0.10、0.20 mg/mL)及5-FU(1 000 μg/mL)作用48 h。收集上清，胰酶消化收集细胞，PBS洗2次，根据制造商的说明书使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(碧云天)检测染色样品用流式细胞仪(艾森生物)分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 鲜茵陈提取物对肝癌HepG2细胞增殖的影响

MTT法检测肝癌HepG2细胞增殖的情况，结果显示，5-FU组(阳性药)及不同浓度的鲜茵陈提取物作用HepG2细胞24、48、72 h的抑制率与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.001)。不同浓度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.40 mg/mL)的鲜茵陈提取物处理肝癌HepG2细胞48 h的抑制率分别为45.8%、55.9%、59.3%、66.7%、73.4%，而0.10 mg/mL的鲜茵陈提取物处理HepG2细胞24、48、72 h的抑制率分别为23.6%、55.9%和65.5%，统计分析结果显示：鲜茵陈提取物对肝癌细胞的生长具有一定的抑制作用(P<0.001)，且呈良好的时间和浓度依赖性。见图1～4,表1。

表1 5-FU和鲜茵陈提取物对HepG2细胞生长的抑制作用

注：与对照组比较，***P<0.001。

注：与对照组比较，***P<0.001。

2.2 鲜茵陈提取物对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

Annexin V阳性的细胞代表早期凋亡和晚期凋亡。流式细胞仪检测结果表明：HepG2细胞用不同浓度的鲜茵陈提取物作用48 h,不同浓度的提取物所导致的早期凋亡率分别为8.54%、12.80%、12.32%、13.97%，对照组为1.94%，总凋亡率为23.33%、31.06%、27.76%、34.49%，对照组为15.94%。随着提取物浓度的增加，细胞早期凋亡率以及总凋亡率逐渐增加，与对照组相比较，统计学分析无显著性差异。见图5和表2。

注：与对照组比较，***P<0.001。

注：与对照组比较，***P<0.001。

注：将细胞接种于6孔板中24 h，然后用不同浓度的提取物处理48 h，用Annexin V/PI染色检测细胞凋亡率。结果代表了3个独立的实验。

表2 不同组别的凋亡率

3 讨论

采用鲜中药治疗疾病是中医中药的特色之一，具有悠久的历史。“鲜中药”包括鲜动物药和鲜植物药，我国很多医药的古籍都记载了鲜中药在治疗疾病中使用，比如《神农本草经》《伤寒论》《金匮要略》《肘后方》《本草逢原》《本草纲目》等，其中仅明代《本草纲目》中就有1 100多条运用鲜中药的记录，《神农本草经》里记载的“生者尤良”中的“生者”即指“鲜的”，《温病条辨》用鲜地黄、鲜麦冬、鲜石蘸等治温病以清热保津，用鲜芦根凉解里热，用鲜菖蒲去热宣窍，而且古方有三鲜饮：鲜藕、鲜茅根、鲜小蓟。近年也有临床应用鲜中药治疗疾病的报道，如用大剂量鲜芦根治疗黄疸型肝炎、肝硬化腹水，鲜蒲公英为主药治疗浅表性胃炎和胃溃疡，鲜仙人掌治疗流行性腮腺炎等。新鲜药所含的活性成分，尤其是挥发性芳香物质含量高于干品。

茵陈除了具有传统的清热利湿、利胆退黄作用外，还具有解热镇痛[15-16]、抗肿瘤、抗炎[17-19]、降血压、抗病毒[20-21]等多种功效。其中茵陈色原酮可以阻滞细胞周期从而抑制前列腺癌细胞增殖[22]，并通过影响金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9来影响肿瘤细胞的侵袭，还有抗人多发性骨髓瘤的作用[23]。杨太成等[24]将茵陈的水提物浓缩干燥并分离纯化，发现其中有6个吸收峰对人肝癌细胞有生长抑制和杀伤作用。茵陈蒿乙酸乙酯提取部分能够通过阻断PI3K/AKT通路来诱导肝癌细胞的凋亡[25]。临床观察到鲜茵陈应用于治疗黄疸型肝炎的疗效优于干品，且茵陈具有保肝利胆的作用，因此笔者对鲜茵陈提取物抗肝癌的疗效进行了初步研究，与他们的研究结果一致，笔者发现鲜茵陈提取物对肝癌HepG2细胞的增殖有一定的抑制作用，并且可能对其凋亡有促进作用，其体外抗肿瘤活性还需进一步的研究。