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鲜茵陈提取物对人肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的作用

2021-01-04袁满张君利傅风华吕剑涛

中医药信息 2020年6期
关键词:茵陈蒿茵陈提取物

袁满,张君利,傅风华,吕剑涛*

(1.烟台大学药学院,山东 烟台 264005;2.滨州医学院烟台附属医院,山东 烟台 264005)

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是原发性肝癌中的一种,根据流行病学显示,肝细胞癌占原发性肝癌比例约为85%~90%。据以往的研究表明[1-2],肝细胞肝癌在亚洲的发病率和病死率都很高,严重威胁着人类的健康[3-4]。

由于肝癌缺乏典型的早期临床表现而且恶性转化的程度较高,大部分的肝癌患者确诊时已经出现了侵袭或转移,肿瘤侵袭或转移是导致肝癌患者死亡的重要原因,因此肝癌的病死率较高。

目前治疗肝癌的方法主要有手术切除、肝移植和放化疗法[5-8],其中手术治疗是主要手段,化疗是辅助手段,但术后极易复发转移,而且容易出现感染,大部分的化疗药物对肝癌的敏感性差,且全身的毒副作用大,因此肝癌患者的5年生存率一般不超过50%。

中医学认为肝是主宣泄,主藏血,有调节精神情志,以促消化吸收,维持气血、津液运行的功能。茵陈来自菊科植物茵陈蒿(ArtemisiacapillarisThunb.)或滨蒿(ArtemisiascopariaWaldst.et Kit.)的干燥地上部分,是中医常用保肝利胆药。有研究表明[9],茵陈蒿能够降低黄曲霉素B1所诱发的染色体变异和基因突变,洪振丰等研究[10]表明茵陈蒿水煎剂可以下调实验性的食道肿瘤大鼠肿瘤组织的cdk2和p53表达。另外,也有学者研究发现茵陈具有一定的抗肿瘤活性,蒋幼凡等[11]发现茵陈蒿的提取物茵陈素能够抑制肺癌细胞增殖,引起细胞周期的阻滞,诱导细胞出现凋亡的特征,茵陈提取物对其他多种肿瘤也具有抑制作用,包括肾癌[12]、鼻咽癌[13]等,茵陈提取物茵陈色原酮能够抑制乳腺癌的侵袭[14]。综上,茵陈具有抗肿瘤作用,但对于茵陈抗肝癌作用的研究相对较少,因此笔者对鲜茵陈提取物对肝癌细胞HepG2细胞的作用进行研究。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

鲜茵陈提取物由滨州医学院烟台附属医院提供。氟尿嘧啶注射液(5-FU,批号:FA171116,旭东海普);MEM(批号:0050819,BI);胎牛血清FBS(批号:42Q1670K,Gibco);四氮甲唑蓝(MTT,北京索莱宝公司);二甲亚砜(DMSO,批号:1121E036,北京索莱宝公司);磷酸盐缓冲液(PBS,上海伦诺生物医药技术有限公司);Annexin V-FITC/PI 试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);HepG2细胞株(中国科学院细胞库)。

1.2 试剂的配制

1.2.1 茵陈提取物溶液的配制

用培养基稀释提取物至所需浓度。阳性对照组为5-FU用培养基稀释至所需浓度。对照组为含10%FBS的MEM培养液。

1.2.2 PBS的配制

将PBS粉末溶于去离子制成浓度为0.01 mol/L溶液。

1.2.3 MTT的配制

用0.01 mol/L PBS溶液配制成5 mg/mL浓度,4 ℃避光保存。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

人肝癌HepG2细胞株购于中国科学院细胞库,用BI公司的MEM培养基,添加10%FBS和1%双抗培养细胞,将细胞置于37 ℃的加湿培养箱中,并在5% CO2环境中进行培养。

1.3.2 MTT实验

将对数期生长的HepG2细胞用胰酶消化,使用EMEM培养基稀释,将100 μL(5×103个/孔)的细胞悬液接种于96孔板,培养24 h后,添加5-FU(阳性药)和鲜茵陈提取物,使其终浓度分别为1 000 μg/mL和0.05、0.10、0.15、0.20、0.40 mg/mL,每个浓度增加5个副孔,对照孔加等量细胞和培养液。在37 ℃,5% CO2的培养箱中培养24 h或48 h,加MTT(5 mg/mL)20 μL/孔,继续培养4 h,吸弃上清,加DMSO 150 μL/孔,摇床振荡10 min,酶标仪490 nm波长下检测个吸光度(A)。按照如下公式计算:

抑制率(%)=(1-实验组A均数/对照组A均数)×100%

1.3.3 流式细胞仪检测细胞凋亡

将处于对数生长期的人肝癌HepG2细胞以1×105/孔的密度接种于6孔板上,培养24 h后加入不同浓度的鲜茵陈提取物(0.025、0.05、0.10、0.20 mg/mL)及5-FU(1 000 μg/mL)作用48 h。收集上清,胰酶消化收集细胞,PBS洗2次,根据制造商的说明书使用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(碧云天)检测染色样品用流式细胞仪(艾森生物)分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 鲜茵陈提取物对肝癌HepG2细胞增殖的影响

MTT法检测肝癌HepG2细胞增殖的情况,结果显示,5-FU组(阳性药)及不同浓度的鲜茵陈提取物作用HepG2细胞24、48、72 h的抑制率与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.001)。不同浓度(0.05、0.10、0.15、0.20、0.40 mg/mL)的鲜茵陈提取物处理肝癌HepG2细胞48 h的抑制率分别为45.8%、55.9%、59.3%、66.7%、73.4%,而0.10 mg/mL的鲜茵陈提取物处理HepG2细胞24、48、72 h的抑制率分别为23.6%、55.9%和65.5%,统计分析结果显示:鲜茵陈提取物对肝癌细胞的生长具有一定的抑制作用(P<0.001),且呈良好的时间和浓度依赖性。见图1~4,表1。

表1 5-FU和鲜茵陈提取物对HepG2细胞生长的抑制作用

注:与对照组比较,***P<0.001。

注:与对照组比较,***P<0.001。

2.2 鲜茵陈提取物对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

Annexin V阳性的细胞代表早期凋亡和晚期凋亡。流式细胞仪检测结果表明:HepG2细胞用不同浓度的鲜茵陈提取物作用48 h,不同浓度的提取物所导致的早期凋亡率分别为8.54%、12.80%、12.32%、13.97%,对照组为1.94%,总凋亡率为23.33%、31.06%、27.76%、34.49%,对照组为15.94%。随着提取物浓度的增加,细胞早期凋亡率以及总凋亡率逐渐增加,与对照组相比较,统计学分析无显著性差异。见图5和表2。

注:与对照组比较,***P<0.001。

注:与对照组比较,***P<0.001。

注:将细胞接种于6孔板中24 h,然后用不同浓度的提取物处理48 h,用Annexin V/PI染色检测细胞凋亡率。结果代表了3个独立的实验。

表2 不同组别的凋亡率

3 讨论

采用鲜中药治疗疾病是中医中药的特色之一,具有悠久的历史。“鲜中药”包括鲜动物药和鲜植物药,我国很多医药的古籍都记载了鲜中药在治疗疾病中使用,比如《神农本草经》《伤寒论》《金匮要略》《肘后方》《本草逢原》《本草纲目》等,其中仅明代《本草纲目》中就有1 100多条运用鲜中药的记录,《神农本草经》里记载的“生者尤良”中的“生者”即指“鲜的”,《温病条辨》用鲜地黄、鲜麦冬、鲜石蘸等治温病以清热保津,用鲜芦根凉解里热,用鲜菖蒲去热宣窍,而且古方有三鲜饮:鲜藕、鲜茅根、鲜小蓟。近年也有临床应用鲜中药治疗疾病的报道,如用大剂量鲜芦根治疗黄疸型肝炎、肝硬化腹水,鲜蒲公英为主药治疗浅表性胃炎和胃溃疡,鲜仙人掌治疗流行性腮腺炎等。新鲜药所含的活性成分,尤其是挥发性芳香物质含量高于干品。

茵陈除了具有传统的清热利湿、利胆退黄作用外,还具有解热镇痛[15-16]、抗肿瘤、抗炎[17-19]、降血压、抗病毒[20-21]等多种功效。其中茵陈色原酮可以阻滞细胞周期从而抑制前列腺癌细胞增殖[22],并通过影响金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9来影响肿瘤细胞的侵袭,还有抗人多发性骨髓瘤的作用[23]。杨太成等[24]将茵陈的水提物浓缩干燥并分离纯化,发现其中有6个吸收峰对人肝癌细胞有生长抑制和杀伤作用。茵陈蒿乙酸乙酯提取部分能够通过阻断PI3K/AKT通路来诱导肝癌细胞的凋亡[25]。临床观察到鲜茵陈应用于治疗黄疸型肝炎的疗效优于干品,且茵陈具有保肝利胆的作用,因此笔者对鲜茵陈提取物抗肝癌的疗效进行了初步研究,与他们的研究结果一致,笔者发现鲜茵陈提取物对肝癌HepG2细胞的增殖有一定的抑制作用,并且可能对其凋亡有促进作用,其体外抗肿瘤活性还需进一步的研究。

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