陕产七叶一枝花的生药学研究△

杨琳，程江雪，王艳，彭亮，高静，杨新杰，张岗，颜永刚*，程虎印*

1.陕西中医药大学 药学院/陕西省秦岭中草药应用开发工程技术研究中心，陕西 咸阳 712046；2.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043

七叶一枝花ParispolyphyllaSm.为百合科重楼属粗壮根茎类的南重楼组药用植物，是陕西灯台七、重楼药材的基原植物[1]。七叶一枝花主要分布于我国西藏东南、云南、贵州和四川等地[2]，在陕西也有分布。根据本草考证，七叶一枝花最早在陕西的记录出现于《本草图经》：“蚤休，即紫河车也，俗呼金线重楼。生……今河中、河阳、华、凤、文州及江淮间亦有之。苗叶似王孙、鬼臼等，做二、三层；六月开黄紫花，蕊赤黄色，上有金丝垂下；秋结红子；根似肥姜，皮赤肉白。四、五月采根，日干用”[3]，由此植物形态特征判断其应为七叶一枝花，“华”应为华州，今陕西省渭南市华阴市、华州区、潼关县一带；“凤”即为凤州，今陕西省凤县。《陕西中药志》1962年版记载中药重楼为“百合科(Liliaceae)植物重楼ParispolyphyllaSm.的根茎。……主产于山阳、紫阳、陇县、宁强、凤县、南郑、华县等县区及太白山地区”[4]。七叶一枝花在陕西的药用历史源远流长，近年来陕西省第四次中药资源调查初步结果表明，其在陕西渭北高塬的耀州区和黄龙、秦岭南北坡各县、大巴山脉之镇巴县、勉县等地多有分布[5-8]。重楼属南重楼组植物的粗壮根茎作为陕西中药市场重楼的统货，具有止血、镇痛、抗炎抑菌、收缩子宫和抗肿瘤等作用[9-13]。

陕产七叶一枝花在民间当灯台七使用，所含活性成分主要为重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等[9-16]。已有学者对七叶一枝花营养器官的显微结构及皂苷含量进行了研究[17-19]，但目前对陕产七叶一枝花的生药学研究较少。本实验研究了七叶一枝花的形态特性、生药性状及其显微特征，并参照《中华人民共和国药典》[20](以下简称《中国药典》)2015年版重楼项下方法测定了重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总含量，为厘清来源及合理利用陕产七叶一枝花植物资源提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

Nikon D750型数码照相机(尼康株式会社)；LEICA RM2235型切片机(德国徕卡公司)；HD-360型生物组织自动染色机(湖北慧达仪器有限公司)；ZEISS Imager.A2型显微镜(德国蔡司公司)；FA2104型电子分析天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；UltiMate 3000型高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；Inertsil ODS(C18)型高效液相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本岛津公司)。

1.2 试药

10批七叶一枝花样品采自陕西省七叶一枝花主产县域阴湿的落叶阔叶林或人工阔叶林下(见表1)，经陕西中医药大学程虎印教授、颜永刚教授鉴定为七叶一枝花ParispolyphyllaSm.。

表1 陕产七叶一枝花生药采集地点信息

对照品重楼皂苷Ⅰ(批号：10575-201410)、重楼皂苷Ⅱ(批号：10576-201409)、重楼皂苷Ⅵ(批号：10577-201411)、重楼皂苷Ⅶ(批号：10578-201411)均购自南昌贝塔生物科技有限公司，纯度均大于98%；娃哈哈牌瓶装纯净水；乙醇(分析纯)；甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；其余所有试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 生物学特性及生长习性观察

通过野外资源考察及对仿野生基地长期观察的方式，实地观察七叶一枝花的生长特性，用数码相机拍照，记录原植物形态。

2.2 性状鉴别

8月初采挖6年以上的实生苗，观察七叶一枝花根茎的性状特征，并对其根茎的形状、大小、表面颜色、质地以及断面等进行描述，用数码相机对观察到的特征进行拍摄记录。

2.3 显微特征鉴别

对七叶一枝花药材根茎的横切面和粉末进行制片，利用显微镜观察根茎及粉末结构及特征，拍摄组织显微照片，记录其显微特征及数据。

2.4 含量测定

2.4.1色谱条件及系统适用性 色谱柱为Inertsil ODS(C18)(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以流动相水(A)-乙腈(B)进行梯度洗脱(0～10 min，30%～40%B；10～15 min，40%～60%B；15～35 min，60%～70%B；35～45 min，70%～75%B)。柱温：25 ℃；检测波长：203 nm；流速：1 mL·min-1；进样体积：30 μL。理论板数按重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ计算均不低10 000。空白对照、混合对照品、供试品的HPLC图见图1。

注：A.空白对照；B.混合对照品；C.供试品(第8批)；1.重楼皂苷Ⅶ；2.重楼皂苷Ⅵ；3.重楼皂苷Ⅱ；4.重楼皂苷Ⅰ。图1 空白对照、混合对照品及供试品的HPLC图

2.4.2对照品溶液制备 精密称取重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ 2 mg，分别置于5 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度为0.4 mg·mL-1的对照品溶液，备用；精密吸取上述4种对照品溶液各1.5 mL，置于同一10 mL量瓶中，摇匀，用甲醇定容，即得混合对照品储备液。

2.4.3供试品溶液的制备 将生药干燥后粉碎成粗粉，精密称取药材粉末2.0 g，置于锥形瓶中，加入25 mL 90%乙醇，浸泡0.5 h后，连续回流提取2次，合并滤液，完全蒸发续滤液中溶剂，向其中加入甲醇溶解，并定容至10 mL量瓶内，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4.4方法学考察 按照相关标准进行方法学试验[21]，结果显示，精密度、稳定性及重复性试验中供试品峰面积的RSD分别为0.16%～0.57%、1.62%～4.79%、2.17%～3.88%，均在规定范围内，表明仪器精密度良好，供试品溶液稳定性、方法重复性较好，方法准确度良好。加样回收率试验中，4个成分的RSD分别为5.31%、5.79%、5.28%、4.19%。

2.4.5含量测定 取10批样品各适量，分别按2.4.3项下方法制备供试品溶液，再按2.4.1项下色谱条件进样测定，并以干燥品计算含量。

3 结果

3.1 生物学特性及生长习性

陕产七叶一枝花为多年生直立草本，株高25～90 cm；茎单一，无毛，常带紫红色，基部有灰白色干膜质的鞘1～3枚；根状茎横走而粗厚，直径1～2.5 cm，长1.5～5.8 cm，外面棕褐色，密生多数斜横环节和须根，上面有一列多数凹陷茎痕；叶7～12枚，轮生，叶片矩圆形、椭圆形或倒卵状披针形，长7～16 cm，宽1.8～3 cm，先端短尖或渐尖，基部圆形或宽楔形，羽状网脉；叶柄明显，长0.3～1 cm，常带紫红色；花单生于叶轮中央，花梗似为茎的延续，长6～18 cm；花基数(3-)4～8；花被2轮，离生，宿存，外轮花被片绿色，叶状，狭卵状披针形或长椭圆形，长(3-)4.5～5 cm，宽1.2～2.3 cm，内轮花被片狭条形，绿色至黄绿色，长3～7 cm，通常比外轮长；雄蕊2轮，花药长0.5～0.8 cm，与花丝近等长或稍长，药隔突出部分长0.1～0.2 mm；子房近球形，具5～6棱，顶端具一盘状花柱基，花柱粗短，具(4-)5分枝，中上部侧下反曲；蒴果紫色至墨绿色，直径1.5～2.5 cm，3～6瓣裂开；种子多数，具鲜红色多浆汁的外种皮。花期4—7月，果期8—10月。

该种的叶片形状、叶柄长度与颜色、叶基与叶尖形态有明显变化幅度；内轮花被片长度比外轮花被片短、近等长或显著长；生长年限越长的植株，其株高、叶片数、花基数、根茎直径与长度、果实大小及成熟种子数等均有不同程度增加。陕产七叶一枝花根茎在花形成前生成的根茎较细，花形成之后根茎显著膨胀变粗，至顶部最粗，略弯曲或呈结节状，表皮棕褐色，横斜环纹较为粗厚，突起明显；顶芽唯一，常自7月中旬—8月中下旬的花期末至果期初萌发，至次年3月地上实生苗出土时持续生长。由此可见，根茎显著持续膨大似与有性生殖过程相关。其根茎有别于华重楼P.polyphyllaSm.varchinensis(Franch.)Hara根茎的粗壮、较长及狭叶重楼P.polyphyllaSm.var.stenophyllaFranch.根茎较细、较短等。其栽培方式的生长特性与具柄重楼P.fargegiiFranch.var.Petiolata(Baker ex C.H.Wright)Wang et Tang[21]、宽叶重楼P.polyphyllaSm.var.latifoliaWang et Chang[22]较为相似，对生长环境条件的选择较为专性。陕产七叶一枝花的原植物、花、果实种子及腊叶标本见图2。

注：A.原植物；B.花；C.果实种子；D.腊叶标本。图2 陕产七叶一枝花的原植物、花、果实种子及腊叶标本

3.2 生药性状

生药为无(或切去)顶芽、除去须根的干燥根茎，为较粗壮的结节状不匀扁圆柱体，不同程度弯曲，长2.2～9.8 cm，直径不均匀；表面呈棕褐色，有粗斜层状环形突起，结节显著，尾部为最初形成的根茎，较细，向顶部逐步加粗，有时顶部有凹陷茎痕或干燥皱缩的芽体及平齐的芽体切面，根茎底面有显著的凹窝状白色须根痕，质地坚实，断面呈乳白色，较为平整，粉性强；气微，味微苦、麻。见图3。

图3 陕产七叶一枝花的生药性状特征

3.3 生药显微特征

3.3.1横切面 其最外为一层表皮细胞，细胞壁栓化，外切向壁明显较厚，呈棕褐色，细胞排列较为紧密，无细胞间隙，细胞多呈近圆形、短矩形，切向稍延长。部分表皮破裂或剥落。皮层宽广，由外及里依次为外皮层细胞2～4层，稍大于表皮细胞，部分细胞因外切向壁稍木栓化而呈浅褐色，排列较整齐紧密，少有细胞间隙，无或很少含淀粉粒；皮层薄壁组织28～32层细胞，呈类方形、类圆形或类多角形，大小较为均匀，排列不整齐，细胞间隙显著存在；根迹维管束外围为维管束鞘包围，厚约7～13层薄壁细胞，内有不规状大型细胞间隙连成的通气组织，最内和最外层各为1～2层、环围排列较为整齐紧密。生活细胞内均含大量淀粉粒，普遍较小；死亡细胞内含针晶束较多，普遍较大，长20～60 μm，宽10～40 μm。黏液细胞偶见。内皮层1层，明显存在，排列较为整齐、不连续。皮层整体宽度与中柱半径之宽度约为2.5∶1。

中柱构造为基本组织细胞之中散布大小不一的周木式维管束。中柱鞘与皮层、中柱的界限不显著，薄壁细胞的大小不均、排列不整齐，存在明显细胞间隙，含极多淀粉粒和针晶束。有6～10个大小不一的周木式维管束散布于中柱近外围区域，呈圆形、不规则形或椭圆形，有的2～3个黏连一起成群排列。黏液细胞偶见。40倍光学显微镜下特征见图4。

注：A.详图；B.简图；1.栓化表皮；2.皮层；3.细胞间隙；4.草酸钙针晶；5.根迹；6.维管束鞘；7.内皮层；8.周木式维管束；9.黏液细胞。图4 陕产七叶一枝花横切面结构部分详图及简图

3.3.2药材粉末 药材粉末基本为白色，略呈淡棕黄色。淀粉粒多呈球形、矩圆形甚或钝三角形，极多，绝大多数为单粒，较少的复粒淀粉属多粒聚合型，脐点明显存在，为条状、裂隙状、星状或狭缝状，层纹不明显，单粒淀粉直径2～25 μm。针晶极多，暗灰色，呈束簇状排列或散列，单针晶长约24～61 μm。导管较常见，主要类型为螺纹导管、梯纹导管、网纹及梯-网纹导管，直径约12～40 μm。见图5。

注：A.详图；B.简图；1.淀粉粒；2.针晶(束)；3.螺纹导管；4.梯纹导管；5.网纹导管；6.梯-网纹导管。图5 陕产七叶一枝花药材粉末显微特征

3.4 重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ含量测定

测定结果表明，陕产七叶一枝花生药中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总含量均在2%以上，符合《中国药典》2015年版标准，见表2。

表2 陕产七叶一枝花生药中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ质量分数(n=3) %

4 讨论

陕产七叶一枝花来源明确，为百合科重楼属南重楼组植物七叶一枝花P.polyphyllaSm.，其具有独特的生长特性，分类特征与其变种和具柄重楼易于区别。合格药材的最低生长年限、性状、最佳采收期、其他活性组分、与《中国药典》2015年版收载中药重楼药效比较研究等是今后七叶一枝花研究工作的主要方向。

其生药横切面显微构造中具有1层表皮细胞、内皮层细胞排列为不连续的轮廓环形、6～10个类圆形周木式维管束散布排列等特征性结构，根迹维管束的维管束鞘中有通气组织样的连续细胞间隙，与原植物阴湿的自然适生环境相符[23]，连同条状、星状、裂隙状或狭缝状脐点的(类)球形淀粉粒等生药粉末特征，与《中国药典》2015年版中七叶一枝花[20](应为华重楼[2])和云南重楼[20](应为宽瓣重楼[2])1层表皮、间断排列的内皮层、25个以上的小型周木维管束散布、生药粉末中所含淀粉粒等特征[13，23]区别显著，是显微鉴别所依据的主要指标。

陕产七叶一枝花根茎入药有两重性，其在本地是以灯台七、海螺七入药的种之一，性味功能为“味微甘、苦，性寒，有毒。清热解毒，消肿散结，镇惊止痛”，主治“疮疖痈肿，跌打损伤，毒蛇咬伤，瘰疠，癌肿，小儿惊风”[24]。民间鲜品咬敷可止牙痛，同时又在中药市场上以重楼同名等效入药。按照《中国药典》2015年版表述为“性味与归经：苦、微寒；有小毒。归肝经。功能与主治：清热解毒，消肿止痛、凉肝定惊。用于疔疮痈肿，咽喉肿痛，蛇虫咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐”，两者既有相通性又有区别。本研究表明，陕产七叶一枝花有效组分重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ总含量超过了《中国药典》2015年版规定的0.6%，一定程度上表明其与重楼同名等效入药的合理性，但能否作为替代资源、地方性的“灯台七”与中药重楼通用的合理性有待进一步研究。

陕西产七叶一枝花根茎入药，有许多地方名称如灯台七[1]、海螺七[24]、蒲蓝(华阴)[25]等，部分文献使用非标准名称、地方名称、学名直译(多叶重楼)与《中国药典》错误引注法定药用植物名称，或还有植物名与中药名等混淆交错在一起，加之七叶一枝花特有的变化性形态特性，一定程度上干扰并影响了对原植物的科学认知、准确记述与合理药用。本研究对陕西省产的七叶一枝花生物学特性和生药学的初步研究，厘清了陕产中药重楼的主要来源，为制订陕产重楼质量标准[26]、研究陕产重楼属其它粗壮根茎类的生药学特征以及合理开发地方特色中药材资源提供了参考。