基于4种序列的辽产苍术属植物DNA条形码鉴定△

尹海波，邓聪，王娜，任雪，陈吉祥

辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600

菊科苍术属(AtractylodesDC.)植物为多年生草本，我国境内有5种，辽宁地区有4种，分别为关苍术A.japonicaKoidz.ex Kitam、朝鲜苍术A.coreana(Nakai)Kitam、茅苍术A.lancea(Thunb.)DC.[1](引种栽培)、北苍术A.chinensis(Bunge)Koidz.[2]。苍术首载于《本草经集注》[3]，名为“赤术”。《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版以茅苍术和北苍术干燥根茎为苍术的正品基原，主治湿阻中焦、风湿痹痛等症[4]。

DNA条形码鉴定技术是一种在分子水平上具有很高可靠性的物种鉴定方法[5-6]。《中国药典》2015年版以内转录间隔区2(ITS2)作为DNA条形码鉴定技术的主要序列片段，以psbA-trnH序列片段为辅鉴定物种[7]。matK基因是保证叶绿体功能正常运行的重要基因之一[8]，广泛应用于枸杞、姜科植物、灯盏花等物种鉴定[9-11]。rbcL基因在光合作用和光呼吸中起关键作用[12]，应用于浙贝母、阳春砂、鸢尾属植物等物种的鉴别[13-15]。因此，本研究使用这4种序列片段对辽宁省苍术属植物进行研究，探究适合苍术属分类的基因序列，并探究种内与种间、野生品与栽培品之间的差异，为辽宁省苍术属植物规范化栽培种植提供参考。

1 材料

1.1 药材

通过野外收集及栽培基地走访，共收集辽宁地区苍术属植物4种，共43份样品，其中朝鲜苍术Atractylodescoreana(Nakai)Kitam 23份、茅苍术A.lancea(Thunb.)DC 3份、关苍术A.japonicaKoidz. ex Kitam 6份、北苍术A.chinensis(DC.) Koidz 11份，所有样品经辽宁中医药大学中药资源教研室尹海波教授鉴定，样品存放于辽宁省中药原料质量检测技术服务中心。样品信息见表1。

表1 辽宁苍术属植物样品信息

续表1

1.2 试剂

DP320新型植物基因组提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；2×EsTaqMasterMix (Dye)(北京康为世纪生物科技有限公司)；引物(北京六合华大基因股份有限公司)；琼脂糖及溴化乙锭(上海Sangon公司)；Trans 2k DNA Marker(大连宝生物股份有限公司)；无水乙醇等试剂(天津科密欧有限公司)。

1.3 仪器

PT-35SL型微量电子天平[华志(福建)电子科技有限公司]；TGL-16M型高速离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司)；HH-ZK型数控恒温水浴锅(巩义市予华仪器有限公司)；G1000改进型基因聚合酶链式反应(PCR)仪(杭州博日科技有限公司)；4100型凝胶成像处理系统(上海天能科技有限公司)；涡旋混匀器(德国IKA公司)；ABI3730XL型测序仪(美国Applied Biosystems公司)；移液枪(美国赛默飞世尔公司)；BCD-451WDEMU1型冰箱(青岛海尔股份有限公司)。

2 方法

2.1 总DNA提取

选取干燥叶片，使用75%乙醇擦拭表面，干燥后放入无菌研钵，加入适量液氮研磨成细粉，称取20 mg粉末，用试剂盒提取苍术总DNA，操作步骤及注意事项均遵照试剂盒说明书。

2.2 PCR扩增体系及条件

PCR扩增体系为50 μL，包括2×EsTaqMasterMix (Dye) 25 μL，正反双向引物各2 μL，DNA模板3 μL，加入ddH2O(18 μL)补充至50 μL，充分混匀后备用。PCR扩增结束后，产物经过纯化采用双向测序。引物名称、序列及扩增条件见表2。

表2 引物名称、序列及扩增条件

2.3 数据处理

将测序后的正反向序列使用DNAMAN 8.0软件拼接，使用MEGA 6.0软件进行序列比对，除去低质量区及引物区获得目标序列，将比对好的序列使用邻接法构建系统进化树。

3 结果与分析

苍术属植物共43个样品4种序列通过琼脂糖凝胶电泳检测，DNA提取成功率、扩增成功率均为100%，4种序列双向测序成功率为100%。

3.1 系统发育树聚类分析

基于ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL 4种序列构建系统聚类树，见图1。4种序列系统聚类树聚类结果表明，仅ITS2序列将43个样本的4种苍术属植物各自分为一支，分类清晰；而psbA-trnH、matK、rbcL 3种序列聚类较混乱，种之间不能各自分为一支，因此不能作为4种苍术属植物DNA条形码鉴定的依据。

注：A.ITS2序列；B.psbA-trnH序列；C.matK序列；D.rbcL序列。图1 苍术属植物4种序列系统聚类树

3.2 ITS2二级结构分析

将比对后得到的ITS2序列通过Internal Transcibed Spacer 2 Ribosomal RNA Database(http：//its2.bioapps. biozentrum.uni-wuerzburg.de/#opennewwindow)网站预测二级结构，见图2。图中为4种苍术属植物ITS2序列的二级结构，由1个主环和4个螺旋组成，结构模型均为绿色，显示输入序列为BLAST标识模型，绿色圆点表示同源序列的结构和位置。从图2中可以看出，4种苍术属植物ITS2序列模型相似，但是茎环数目和位置各不相同，茎环大小也有一定差异。

图2 苍术ITS2序列二级结构

3.3 种间和种内变异

43个苍术样品ITS2序列长度均为229 bp，其中种间变异位点有11个，其中朝鲜苍术、茅苍术种内并无差异，关苍术种内G3样品34号位存在1个变异位点C→T，G1～G3样品125号位存在1个变异位点T→A，北苍术种内B8、B10样品206号位存在1个变异位点C→T，见表3。基于ITS2序列的苍术属植物种间遗传变异距离(0.012 494～0.044 865)>苍术属植物种内遗传距离(0～0.003 726)，见表4。

表3 基于ITS2序列的苍术属植物种间及种内变异位点

表4 基于ITS2序列的苍术属植物种间遗传变异距离

4 讨论

苍术作为大宗药材，具有悠久的历史。《辽宁植物志》[2]中记载辽宁苍术属植物有3种，为北苍术、关苍术、朝鲜苍术。而本实验样品中的茅苍术是从江苏茅山引种至辽宁清原。4种苍术属植物的ITS2序列二级结构图显示，朝鲜苍术和北苍术的非同源结构及位置较少，关苍术和茅苍术相似但也有差异，关苍术与其他3种苍术不同之处在于多了1个环状结构。从系统聚类树可知，朝鲜苍术和北苍术为1支，支持率分别为65%和63%；茅苍术和关苍术为1支，支持率分别为63%和62%。4种苍术属植物聚类清晰，因此ITS2序列可作为辽宁苍术属植物DNA条形码的有效序列。

《辽宁植物志》对于北苍术和朝鲜苍术的地理分布记载为“北苍术生于灌丛间或干山坡”“朝鲜苍术生于林下、林缘或干山坡”。姜宇珺等[18]研究结果表明，ITS2序列无法区分北苍术和朝鲜苍术，原因可能是其选用的北苍术均为栽培品，栽培苍术人工干预其生长环境的因素较大，因此导致2种苍术遗传分化不明显。因《辽宁植物志》记载朝鲜苍术和北苍术地理分布和生长环境等有一定差异，郭兰萍等[19]认为，苍术遗传分化和地理分布具有一定相关性，因此产生了差异。

Chase等[20]认为，rbcL基因序列的变异水平在种间水平以上，种间及种内的变异很小，可能是rbcL基因序列不能鉴定苍术属植物的主要原因。Kress等[21]认为，与种间变异相比，psbA-trnH序列的种内变异相对较低。从系统聚类树中得知，matK、psbA-trnH对苍术的物种分离度低，因此不适合鉴定苍术属植物。Chen等[22]对7种序列识别物种的成功率进行了比较，发现ITS2>psbA-trnH>matK>rbcL，而本实验4种系统聚类树结果也验证了ITS2序列的识别能力最强。

马起凤等[23]根据性状推测朝鲜苍术和北苍术均由南苍术(河南以南)演变而来，苍术叶裂这种性状具有不稳定性，不具备一定的分类学意义。从本实验结果ITS2序列片段系统聚类树来看，朝鲜苍术和北苍术确实有较近的亲缘关系；ITS2序列片段不能将叶裂和叶不裂的苍术区分开，变异位点显示叶裂与叶不裂也没有差异，因此，这2种性状可能不是由于基因变异造成的。系统聚类树和变异位点结果表明，苍术属野生品与栽培品没有差异，无法通过DNA条形码鉴定，可以考虑从化学成分、显微结构等方面进行鉴定。《中国植物志》中根据苍术的生态型将北苍术和茅苍术合并为1个种，根据本实验结果，2种苍术在分子生物学鉴定中存在一定差异，建议将北苍术列为茅苍术的亚种，茅苍术作为原亚种较为合适。