骨质疏松骨折相关血清外泌体的对比分析

高春林 许永峰 刘立军 黄洪斌 王金海 袁博 卢立军

骨质疏松是老年人常见的疾病,会导致腰背痛、活动能力下降等影响日常生活的症状,严重的会出现骨质疏松骨折如髋部骨折、脊椎骨折、腕部骨折等并发症,严重影响老年患者的生活质量［1］。骨质疏松的发生与骨吸收/骨形成之间平衡失调有关,在骨吸收/骨形成的平衡调节中,外泌体中的miRNA 起着重要的作用［2］。外泌体是一类能与细胞膜结合的纳米囊泡(直径30～100 nm),研究表明,外泌体内的多种成分如蛋白质、mRNA、miRNA 等信号分子在细胞间信息传递中起重要作用［3］。miRNA 通过与转录本的相互作用,关闭或者抑制基因的表达,在调节骨稳态中具有重要作用。目前骨质疏松的诊断主要依据影像学诊断,如X 线片和骨密度检查等,目前尚无敏感度高的生物学指标。本研究对比分析骨密度正常的老年人和严重骨质疏松骨折的老年患者血清外泌体中miRNA,获得差异化表达的miRNA,为进一步研究骨质疏松骨折风险的评价指标和治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年6～12 月于本院骨科门诊及病房诊治的年龄>65 岁明确诊断为严重骨质疏松骨折的老年患者8 例作为A 组,选取同期年龄>65 岁的正常老年人8 例作为B 组。16 例研究对象的平均年龄为(68±6.83)岁。A 组的平均年龄为(67±7.3)岁,B 组的平均年龄为(69±5.1)岁。两组的年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。其中,A 组除特征性的髋部、腕部、肱骨近端、胸腰椎骨折外,骨密度的诊断标准为WHO 推荐的诊断标准：双能X 线吸收测定的骨密度T 值<-2.5 SD,B 组的骨密度T 值：-2.5 SD

1.2 方法

1.2.1 外泌体提取 蓝帽采血管采集受试者的空腹静脉血10 ml,静置后,2000 r/min,离心15 min,留取血清后装入EP 管,置入-80℃的冰箱中冷冻备用。每组随机选取3 例受试者的血清,3000 r/min,离心15 min 后,取上清,加入63 μl ExoQuicktm precipitation 外泌体提取试剂(4∶1),混合均匀后,4℃条件下放置30 min,将孵育好的样品室温下1500 r/min,离心30 min,弃上清,沉淀以100 μl PBS 重悬,即可获得血清外泌体悬液,分装,备用样品于置入-80℃保存［4］。

1.2.2 miRNA 的提取和识别 使用TRIzol 试剂提取外泌体中的miRNA,用ND-1000nanodrop 进行样品的质检,通过质检的样品进行小RNA 文库构建和序列分析(Yingbio 公司)［5］。将结果进行数据分析后检测其外泌体中的miRNA 表达情况,两组间进行对比,得到差异较大且表达量较高的miRNA。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用t 检验。用log2Ratio 方法定量分析两组间差异表达的miRNA。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

两组有表达的miRNA 共728 个,其中有显著差异的miRNA 共29 个。筛选出两组表达差异倍数较大、表达量较高的miRNA 共17 个,其中上调的miRNA 共12 个,下调的miRNA 共5 个。见表1。

3 讨论

随着核酸测序技术的发展,目前出现了大量关于非编码小RNA 的研究,尤其是关于miRNA 的研究。miRNA 被认为是许多严重疾病如恶性肿瘤、慢性代谢性疾病等基因调控网络中重要调节因子。许多研究表明,miRNA 或许可作为许多疾病如恶性肿瘤的诊断标志物［3］。外泌体是细胞间信息传递的重要形式,它可以在细胞间传递蛋白、DNA 和各种非编码小RNA,如miRNA、tRNA 来源的小片段RNA(transfer RNAderived fragments,tRF)等,这类非编码小RNA 作为细胞代谢调控的重要分子被广泛研究［5］。

骨质疏松是老年人的常见病,轻则可以导致腰背部慢性疼痛,重则可以诱发骨质疏松骨折如脊椎压缩骨折、髋部骨折等,严重影响老年人的生活质量［1］。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)、成骨细胞、破骨细胞都可以分泌外泌体［2］,同时这些细胞膜上也都有外泌体的受体,外泌体中包含的miRNA 对成骨细胞、破骨细胞活性的调节起重要作用。唐煜等［6］发现血清外泌体包含的miR-214-3p 和切除卵巢小鼠的骨形成减少有关。来源于矿化阶段的MC3T3-E1 细胞外泌体中多种miRNAs 水平升高,如miR-30d-5p、miR-133b-3p 和miR-140-3,他们可能通过多种途径(如Wnt、insulin、TFG-B、钙离子信号通路)影响成骨细胞的分化和功能。miR-199b、miR-221 和miR-885-5p 可通过RUNX2 来调节成骨细胞的分化。骨细胞外泌体来源的miR-218 可以通过激活Wnt 信号通路来促进成骨分化［7-9］。

关于循环miRNA 与骨质疏松的研究近年来逐渐增多。黄大耿等［10］对比分析了骨质疏松骨折组和非骨质疏松组,发现其中83 种miRNA 有差异,9 种miRNA(miR-21、miR-23a、miR-24、miR-93、miR-100、miR-122a、miR-124a、miR-125b、miR-148a)在 骨 质疏松骨折患者的血清表达明显增高,有可能作为严重骨质疏松的诊断标志物。陈逸青等［2］对比分析骨质疏松患者和非骨质疏松患者的血清,发现3 种miRNA(miR-122-5p、miR-125b-5p、miR-21-5p 表达显著上升,miR-21-5p 的表达和骨吸收标志物CTx 相一致,提示miR-21-5p 可作为骨折生物标志物。miRNA 作为疾病的诊断物具有如下特点：①miRNA 具有高度的保守性,在同一物种内表达较为稳定,发挥其生物学功能,当机体出现异常变化时,相对保守的miRNA 的表达亦出现显著变化。②外周血中循环miRNAs 可因疾病的变化而变化,这样miRNA 在一定程度上能反应疾病的轻重程度。③miRNA 发挥作用的机制为网状调节,即一个miRNA 可同时影响多个靶基因,而一个靶基因也可能被多个miRNA 影响,这种网络化的作用使得由多个miRNA 构成的miRNA 组合与疾病关联的可能性增大。④miRNA 具有组织或(和)细胞特异性,有的miRNA仅在某种特定的细胞或组织中表达,有的miRNA 可出现在外周血当中。此外,外泌体来源的miRNA 还具有以下特点:①外泌体内miRNA 受到血浆中成分的影响较少,成分与性质相对稳定,这样分析结果更精确。②血浆外泌体是细胞间、组织间通讯重要的介质,能随着血流影响到全身各个器官组织,广泛地参与机体各个病理生理过程,其调控范围更广,其内的miRNA的变化对各器官组织的影响更大,更具有诊断价值。③外泌体除了miRNA 外还包含有其他类型的信息,如蛋白质、脂类等,若能联合分析miRNA 与外泌体内的蛋白质组,方便从更多维度的鉴别疾病。④目前已证实,外泌体内miRNA 是具有时间特异性的,是个体、器官、组织特定阶段的特定性标志。即特定的外泌体和外泌体内miRNA 代表着细胞、组织特定的状态,研究外泌体来源的miRNA 将有助于缩小疾病标记物筛查的范围,并且有助于了解特定细胞的特定状态,有助于对疾病可能机制的探索。

在作者的研究中,通过提取正常老年人和骨质疏松骨折的老年人体内血清中的外泌体并分离出miRNA,利用qt-PCR 的方法扩增分离得到miRNA,再通过测序和对比文库的方法确定差异化表达的miRNA 其各自的表达水平,将两组间进行对比分析,得到了的这些有差异的miRNA,再结合既往的文献进行分析,筛选出的骨质疏松骨折特征性的miRNA,这些特征性的miRNA有望能作为严重骨质疏松特征性标志物。通过对比分析,作者发现了17 种miRNA 的表达有明显差异,其中在严重骨质疏松患者中,12 种的表达明显升高,5 种表达明显降低,其研究结果与其他文献的研究结果基本一致［8-10］。在差异化最显著的几个miRNA 中,miR-7843-5p 已在前人报道中发现了其与骨质疏松有关,在去卵巢骨质疏松小鼠模型的骨组织中,miR-7843-5p表达高于对照组,miR-7843-5p 通过作用于RUNX2 基因,负向调控成骨细胞分化［10］。MiR-3605-5p 参与基质蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的调控,此蛋白酶与Ⅰ型胶原降解密切相关。MiR-3605-5p 表达的降低,可能与巨噬细胞/破骨细胞功能激活有关,从而导致骨质疏松［9］。miR-6747-3p 参与骨相关细胞的分化及功能调控,miR-6747-3p 可通过抑制Smadl,从而干扰Smadl/SMad4 介导的基因激活通路,从而抑制软骨细胞分化［4］。

本研究对比分析了骨质疏松骨折的患者人群与正常老年人群之间差异化表达的miRNA,所获得的miRNA 对骨质疏松骨折具有较好的预警作用。下一步的研究将从中挑选2～3 个miRNA 作为重度骨质疏松的生物学诊断指标或骨折的预警指标。此外,本研究结果不可避免的具有一定的局限性：①由于选取的患者均是来本院治疗的患者,样本的选择具有一定的偏性。②此研究中作者得到了17 种差异表达的miRNA 能否作为诊断骨质疏松骨折或者作为判断骨折风险的指标,需要进一步的理论分析、机制研究和实验验证,这也是下一步的研究方向。