植物乳杆菌和纤维素酶对玉米秸秆降解及糖化效果的影响

刘梦洁， 尹清强， 常 娟， 刘超齐， 王 平*， 党晓伟， 卢富山

（1.河南农业大学动物科技学院，河南郑州 450002；2.河南德邻生物制品有限公司，河南新乡 453000；3.河南普爱饲料股份有限公司，河南周口 466000）

我国作为世界排名前列的农业大国，农作物秸秆资源丰富，其中玉米秸秆作为主要农作物秸秆之一，年产量约达2.3亿t（石祖梁等，2019）。由于玉米秸秆的不合理利用，导致大部分秸秆资源被焚烧或弃置于农田，造成了环境污染和资源浪费。因此玉米秸秆饲料资源的开发对秸秆资源的循环利用和经济的可持续发展具有重要的意义。随着我国畜牧业的快速发展，人畜争粮、饲料原料短缺问题将会成为畜牧业可持续发展的一个制约因素（黄斌，2010）。因此，开发饲料资源，充分利用农作物秸秆，发展节粮型畜牧业，将是畜牧饲料资源开发的重点。

玉米秸秆中富含木质纤维素，并且75%成分是由多糖组成，可将玉米秸秆转化为能量原料。木质纤维素结构复杂，在自然界中稳定存在，很难被降解（桑羽希等，2019）。纤维素、半纤维素和木质素独特的网格结构阻碍着纤维素酶与纤维素的接触，而纤维素的结晶度也会影响着纤维素酶的酶解（Sun 等，2002；Caitriona等，1998）。 为使玉米秸秆得到充分利用，进一步提高玉米秸秆的糖化效率和适口性，本文研究植物乳杆菌、纤维素酶单独和复合处理对普通玉米秸秆和碱处理玉米秸秆处理效果，通过测定不同处理玉米秸秆中纤维素、半纤维素、还原糖含量和pH，感官评定秸秆气味和形态，确定最佳处理组合及发酵和酶解时间，为玉米秸秆饲料资源开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 普通玉米秸秆：试验所用玉米秸秆取自河南省原阳县郊区，挑选干净的玉米秸秆去根，自然风干，经锤片式粉碎机粉碎，室温保存。碱处理玉米秸秆：玉米秸秆经粉碎机粉碎后（80%过16目筛），按照液固比13:1加入水，1000 W、80℃超声波处理30 min；再加入6%（m/m）CaO、2%（m/m）NaOH，84℃水浴处理6 h；降温至室温加入3%（V/V）双氧水，处理4 h，风干，65℃烘箱烘干后粉碎备用。植物乳杆菌：试验所用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）来自河南农业大学饲料生物技术实验室，活菌数调整为1.0×109cfu/mL。纤维素酶：纤维素酶购于山东泽生生物科技有限公司，纤维素酶活活力为32.5 FPU/g。矿物元素营养液：制备矿物元素营养液的成分如表1所示。

表1 矿物元素营养液成分g/L

1.2 试验设计

1.2.1 植物乳杆菌和纤维素酶单独和复合处理玉米秸秆 试验采用单因素设计，分为8个组，分别为普通玉米秸秆组，碱处理玉米秸秆组，普通玉米秸秆+5%植物乳杆菌组，碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌组，普通玉米秸秆+5%纤维素酶组，碱处理玉米秸秆+5%纤维素酶组，普通玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组，碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组。每组3个重复，每个重复称取10.00 g玉米秸秆按固液比1:4（其中3、4、7、8组按固液比1:1.5添加营养液）于聚乙烯包装袋中，121℃、20 min高压灭菌，冷却至室温。用真空包装机封口，置于40℃恒温培养箱中发酵和酶解7 d。发酵和酶解结束后，取湿样进行感官评定（气味、颜色、质地），测定pH，剩余样品自然风干。

1.2.2 最佳酶解和发酵时间 根据上述试验结果，选择还原糖含量高的组合碱处理玉米秸秆+5%纤维素酶和碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶探究最佳发酵和酶解时间。酶解和发酵条件同上，每组21个重复，每天取3个重复，共发酵和酶解7 d。酶解结束后，取湿样测定pH，剩余样品自然风干，粉碎。

1.3 指标测定

1.3.1 pH测定 称取0.5 g发酵后湿玉米秸秆于10 mL离心管中，加入4.5 mL蒸馏水，振荡均匀后，用电子酸度计测定pH。

1.3.2 纤维素、半纤维素测定 采用滤袋法测定中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）含量 （Van Soest等，1991）。纤维素和半纤维素计算方法：纤维素=ADF-ADL-灰分；半纤维素=NDF-ADF。

1.3.3 还原糖测定 取处理后玉米秸秆0.5 g加入10 mL蒸馏水，放于30℃、200 r/min摇床中12 h后，取上清液测定还原糖，采用DNS法（孙伟伟等，2006）。

1.4 数据统计 试验数据采用SPSS 24.0统计软件进行单因素分析，并用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05表示差异显著，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 发酵和酶解对玉米秸秆中纤维素、半纤维素、还原糖和pH的影响 由表2可知，碱处理玉米秸秆中纤维素含量显著高于普通玉米秸秆（P<0.05），半纤维素和还原糖显著低于普通玉米秸秆（P<0.05）。与普通玉米秸秆相比，普通玉米秸秆+5%纤维素酶和普通玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组玉米秸秆中纤维素降解率分别为23.56%和14.67%（P<0.05），半纤维素降解率分别降低5.97%和6.16%（P>0.05），还原糖含量分别提高1.32倍和0.47倍（P<0.05）；普通玉米秸秆+植物乳杆菌组玉米秸秆中纤维素、半纤维素和还原糖含量无显著变化（P>0.05）。与碱处理玉米秸秆相比，碱处理玉米秸秆+5%纤维素酶、碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组玉米秸秆中纤维素降解率分别降低66.61%和53.11%（P<0.05），半纤维素降解率分别降低 52.69%和55.47%（P<0.05），还原糖分别提高43.78倍和29.83倍（P<0.05），碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌组玉米秸秆中纤维素和半纤维素降解率分别降低10.53%和4.5%，还原糖提高0.44倍。这表明纤维素酶酶解和纤维素酶+植物乳杆菌共同发酵和酶解的效果要优于单独植物乳酸菌发酵，碱处理玉米秸秆处理效果优于普通玉米秸秆。

表2 不同发酵和酶解对玉米秸秆纤维素、半纤维素、还原糖和pH的影响

与普通玉米秸秆组和碱处理玉米秸秆组相比，玉米秸秆经植物乳杆菌发酵、纤维素酶酶解和植物乳杆菌+纤维素酶共同发酵和酶解，各组的pH 显著降低（P<0.05）。

2.2 发酵和酶解对玉米秸秆颜色、形态及气味的影响 普通玉米秸秆、普通玉米秸秆+5%植物乳杆菌、普通玉米秸秆+5%纤维素酶和普通玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组处理7 d后颜色未发生变化，均为褐色，且玉米秸秆形态未发生变化，无水浸出。碱处理玉米秸秆、碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌、碱处理玉米秸秆+5%纤维素酶和碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶处理7 d后颜色未发生变化，均为黄色，其中碱处理玉米秸秆+5%纤维素酶和碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组玉米秸秆由固态变成水样。普通玉米秸秆、碱处理玉米秸秆、普通玉米秸秆+5%纤维素酶、碱处理玉米秸秆+5%纤维素酶和碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌组气味未发生变化，是原玉米秸秆的味道；普通玉米秸秆+5%植物乳杆菌组有轻微的酸味；普通玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶和碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组酸香味较浓。这表明用植物乳杆菌和纤维素酶复合发酵酶解玉米秸秆后具有较好风味。

2.3 不同发酵和酶解时间对纤维素、半纤维素、还原糖和pH的影响 由图1（A）可知，随着发酵和酶解时间延长，碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组纤维素含量逐渐降低，在第4天达到最低并趋于稳定，为20.13%；碱处理秸秆+5%纤维素酶组纤维素含量在第5天趋于稳定，为15.18%。在发酵和酶解过程中，碱处理秸秆+5%纤维素酶组纤维素降解率显著低于碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组（P<0.05）。 由图 1（B）可知，碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组半纤维素在第5天达到最低（P<0.05）；碱处理秸秆+5%纤维素酶组半纤维素含量在第6天达到最低 （P<0.05）。除第1天碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组半纤维素含量显著高于碱处理秸秆+5%纤维素酶组（P<0.05）外，在发酵和酶解的第2～5天，碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组半纤维素含量均显著低于碱处理秸秆+5%纤维素酶组（P<0.05），而在第6～7天，两组半纤维素含量趋于稳定，且差异不显著（P>0.05）。 由图 1（C）可知，碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组还原糖含量在第4天达到最高并趋于稳定，为187.25 mg/g；碱处理秸秆+5%纤维素酶组还原糖含量逐渐提高，在第5天达到最高，为292.86 mg/g。除第1天外，碱处理秸秆+5%纤维素酶组还原糖含量显著高于碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组（P<0.05）。 由图 1（D）可知，碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组pH在第5天达到最低并趋于稳定（P<0.05）；碱处理秸秆+5%纤维素酶组pH逐渐降低，在第3天达到最低趋于稳定 （P<0.05）。在发酵和酶解的第1天和3天，碱处理秸秆+5%纤维素酶组pH显著低于碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组（P<0.05），而在第5天，碱处理秸秆+5%纤维素酶组pH显著高于碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组 （P<0.05），第6～7天，两组pH均趋于稳定并且差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

3.1 发酵和酶解玉米秸秆对纤维素、半纤维素、还原糖和pH的影响 胡华佳等（2010）发现，超声波协同稀碱液可破坏稻草秸秆结构，剥离木质素，从而提高秸秆的糖化率。本试验结果表明，与普通玉米秸秆相比，玉米秸秆经过超声波和碱处理后，可有效降解半纤维素和木质素，从而暴露出纤维素，提高纤维素含量，但由于在处理时加有碱液，故pH增高，不利于转化为葡萄糖。纤维素酶的最适pH为4.0～7.0（李豪等，2019），在酶解时需要调到适宜的pH才能最大的发挥酶解功能。而乳酸菌发酵过程中可以产生乳酸、乙酸、丙酸等有机酸，可显著降低玉米秸秆pH（王中华，2002）。本试验结果显示植物乳杆菌发酵玉米秸秆可以降低pH，但是单一植物乳杆菌进行发酵对纤维素和半纤维素降解效果不佳。本试验用纤维素酶发酵普通玉米秸秆和碱处理玉米秸秆，pH均显著降低，为酶解提供适宜的条件。纤维素酶可改变植物细胞壁的通透性，将纤维素水解为还原糖，玉米秸秆中含有丰富的纤维素，尤其是碱处理玉米秸秆，增大纤维素酶与纤维素的接触面积。本试验在两种玉米秸秆中添加纤维素酶进行酶解，均降解玉米秸秆中的纤维素和半纤维素，转化为可被动物消化吸收的还原糖，并且碱处理玉米秸秆效果最佳，与王兴吉等（2019）研究结果一致。在本试验中，将植物乳杆菌和纤维素酶同时加入普通玉米秸秆和碱处理玉米秸秆中进行发酵和酶解发现，碱处理玉米秸秆纤维素、半纤维素降解率和还原糖含量均高于普通玉米秸秆，但是效果低于单一添加纤维素酶，可能是因为纤维素酶与植物乳杆菌同时发酵和酶解时，酶解纤维素产生的还原糖被植物乳杆菌发酵利用 （王目森，2015；张平等，2012），导致还原糖含量降低，而植物乳杆菌发酵主要消耗含糖类物质，对木质纤维素结构几乎没有影响（万江春等，2019）。

3.2 发酵和酶解对玉米秸秆颜色、形态及气味的影响 碱处理玉米秸秆成黄色主要是碱性双氧水氧化的效果，酶解和发酵不能改变玉米秸秆的颜色。碱处理玉米秸秆+5%纤维素酶组和碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组的玉米秸秆由固态变成水样，此结果与纤维素和半纤维素含量减少，还原糖含量增加有关，主要是因为纤维素和半纤维素被分解成可以溶于水的小分子糖，支撑其固体形态的物质减少，所以在发酵酶解过程中试样会变得越来越稀。待酶解和发酵玉米秸秆烘干后其物理性状由原来的体积膨大、容重小、系水性强的蓬松短杆状物质变成体积小、容重大、易溶于水的固体粉状物质，实现了其作为饲料的可行性。乳酸菌常用于玉米秸秆的青贮和和黄贮来提高秸秆的适口性（谢华德等，2019；张适等，2019）。普通玉米秸秆+5%植物乳杆菌组有轻微的酸味，碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌组未产生酸味，主要因为普通玉米秸秆和碱处理玉米秸秆中含糖量少，发酵基质中也没有添加其他的碳水化合物，不能满足植物乳杆菌大量生长。普通玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶和碱处理玉米秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组酸香味较浓，主要是因为在纤维素酶的作用下纤维素和半纤维素分解的还原糖被植物乳杆菌利用来满足其繁殖。

3.3 发酵和酶解的时间对纤维素、半纤维素、还原糖和pH的影响 植物乳杆菌+纤维素酶共同发酵和酶解碱处理玉米秸秆还原糖含量低于纤维素酶单独酶解，但是其风味优于单独酶解。单独纤维素酶酶解秸秆还原糖含量高可以作为能量饲料开发；植物乳杆菌+纤维素酶共同发酵和酶解秸秆既含乳酸菌和乳酸又含还原糖、少量纤维，可以开发功能型饲料，故确定这两组最佳处理时间。

玉米秸秆与纤维素酶酶解的时间是玉米秸秆纤维素与半纤维素降解、还原糖转化量和pH的重要因素之一。酶解时间的增加，改变底物浓度和纤维素酶的浓度，影响纤维素的降解，进而影响玉米秸秆还原糖的转化和pH。张万忠等（2011）研究发现，纤维素酶解率随着玉米秸秆酶解时间的增加而加快，12 h后酶解率增加缓慢。刘纪成等（2019）研究表明，随着花生秸秆发酵时间的增加，发现纤维素酶活性不断增大，但是当达到第10天之后，呈下降趋势。在本试验中，碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组分别在发酵和酶解的第4天和5天 ，纤维素和半纤维素降解率达到最高，之后呈下降趋势；碱处理秸秆+5%纤维素酶组在酶解的第3天和6天，纤维素和半纤维素降解率分别达到最高，之后下降，与前人趋势一致。易锦琼等（2011）研究发现，在反应初始阶段，酶水解转化率增加较快；36 h后，还原糖转化率上升趋势逐渐平缓。田庆文等（2017）研究表明，随着酶解时间的延长，还原糖转化率呈上升趋势且不断增大；在反应的初始阶段，还原糖转化率增加较快，72 h后还原糖转化率上升趋势逐渐平稳。在本试验中，碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组和碱处理秸秆+5%纤维素酶组分别在发酵和酶解的第4天和5天还原糖转化量达到最高；在发酵和酶解的初始阶段，还原糖转化率增加较快，随着酶解时间延长还原糖转换率逐渐降低，可能是因为在反应初始阶段，纤维素酶浓度较高，且与底物充分接触，反应速率增大，而随着反应时间的延长，玉米秸秆经碱处理后暴露出的纤维素基本酶解完成，导致还原糖的转化率降低。纤维素酶主要来自于微生物 （孙喆等，2014）。研究表明，pH在4.0～7.0时，纤维素酶的酶活最高，而在秸秆中添加纤维素酶后pH显著降低（Gupta等，2020；李乐等，2019）。本试验中，碱处理秸秆+5%植物乳杆菌+5%纤维素酶组和碱处理秸秆+5%纤维素酶组的pH随着发酵和酶解时间的延长逐渐降低至酸性，有利于纤维素酶与底物反应，提高还原糖含量，进而增加玉米秸秆饲料的营养价值和适口性。前人研究发现，玉米秸秆经菌-酶复合制剂青贮或黄贮一般需发酵30～45 d可改善秸秆营养品质（毛建红等，2018；曾辉等，2018）。本试验碱处理玉米秸秆在固液比4:1，酶解温度40℃条件下经纤维素酶酶解，还原糖含量在第5天时达到最高，为292.86 mg/g；碱处理秸秆经5%植物乳杆菌+5%纤维素酶共同发酵和酶解5 d即可完成，缩短了发酵和酶解时间。

4 结论

本试验得出，经过碱处理后的玉米秸秆，纤维素和半纤维素的结构发生改变，更有利于酶解；单一纤维素酶酶解玉米秸秆的还原糖含量高于单一植物乳杆菌发酵以及植物乳杆菌+纤维素酶共同发酵和酶解；植物乳杆菌+纤维素酶共同发酵和酶解碱处理玉米秸秆风味优于植物乳杆菌和纤维素酶单一发酵酶解碱处理秸秆。玉米秸秆经过超声波、碱和双氧水处理后，纤维素酶单独酶解5 d，秸秆中还原糖含量达到最高；植物乳杆菌+纤维素酶复合发酵和酶解5 d半纤维素含量和pH达到最低。碱处理秸秆经纤维素酶单独发酵和植物乳杆菌+纤维素酶复合发酵和酶解有利于提高玉米秸秆的消化利用率和适口性，可以开发成不同形式的饲料原料。