锌掺杂氧化锆的制备及其抗菌性能研究

朱晓东

（上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234)

由于遗传因素、意外创伤、细菌感染所导致的牙体缺损、牙面不齐以及牙周炎、龋齿等[1]是口腔常见的疾病。其中，由于细菌感染所导致的“龋齿”被称为世界第三大非传染性疾病。口腔疾病虽然不会直接影响到人们的生命安全，但是却影响着人们的生活质量，经久不治的话，会间接影响着人们的身体健康。临床研究表明，由于细菌感染所造成的牙齿修复失败也是不可忽视的问题。

氧化锆作为无机生物材料研究应用以来，因其具有良好的生物相容性、化学稳定性等性能，被广泛应用于齿科修复领域[2]。其中，钇稳定的四方型氧化锆（Y-TZP）因为具有较高的稳定性，得到了广泛的关注[3]。锌元素作为一种常见的抗菌元素，能够有效抑制口腔细菌形成。例如，谷海晶等人发现，锌盐释放出的Zn2+具有一定的氧化还原性, Zn2+进入细胞后与DNA 反应并破坏酶化合物, 抑制细菌产酸，从而具有抑制菌斑形成、抗菌的作用, 且不同浓度Zn2+抗抑菌效果不同, 同时会影响钙磷灰石晶体形成的类型[4]。

本研究采用化学沉淀法制备纳米级锌掺杂氧化锆粉体，研究了合成条件对粉体形貌和物相的影响规律，并探究了随着锌掺杂量的增加，合成氧化锆对大金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性，以及其生物相容性的研究。

1 实验材料与方法

1.1 Zn-ZrO2 的制备

将八水合氯氧化锆（ZrOCl2·8H2O）溶于蒸馏水中配置成0.5mol/l 的溶液，然后加入六水合硝酸钇（Y（NO3）3·6H2O）和六水合硝酸锌，其中控制钇含量为氧化锆含量的3mol%，锌含量为氧化锆含量的1wt%、1.5wt% 和2wt%。通过搅拌器将混合体系搅拌完全，缓慢滴加氨水调节溶液pH 为10 左右，得到白色沉淀物，再将该悬浮液室温下静置沉淀12h。沉淀物经过过滤，用水和无水乙醇清洗，100℃的条件下烘干。最后700℃煅烧两小时，得到纳米级Zn-ZrO2粉体。

1.2 物相和形貌表征

用X 射线衍射仪（型号D/max2550V，日本）对Zn-ZrO2粉体进行分析并确定其物相成分；采用场发射扫描电子显微镜（型号S-3400，日本）观察Zn-ZrO2粉体表面形貌。

1.3 抗菌性测试

抗菌性测试选用的细菌是最具代表性的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌的培养基采用营养肉汤（NB）培养基。

1.3.1 细菌增殖实验

细菌稀释至浓度为1×107cfu/ml，接着每0.02g 灭菌后的样品中接种500µl 的菌液，并在37℃培养箱中分别培养12h 和24h。再向菌液中加入Alarm Blue 荧光染色剂（菌液与染色剂体积比为9 ：1）。继续培养2h，之后再取100µl 菌液于96 孔板中，采用分光光度计检测其荧光强度，检测范围在560nm 到590nm。

1.3.2 细菌形貌观察

将样品粉末用压片机压制成Φ7mm×3mm 大小的圆片，高温灭菌后与500µl 菌悬液共培养24h，菌液浓度为1×107cfu/ml。之后将与菌液共同培养后的样品片浸入浓度为2.5% 的戊二醛，并置于4℃的条件下避光保存12h。接着依次采用体积比为30%，50%，75%，90%，95%，100% 的乙醇对样品片进行脱水处理，并用六亚甲基硅烷/ 乙醇溶液（1:2，2 ：1（体积比）和纯六亚甲基硅烷）依次干燥10-20min。通风干燥后表面喷金，用电子显微镜观察样品表面的细菌形貌。

1.3.3 细菌涂板

将两种特定浓度的细菌悬液分别接种在含有0.02g 粉体的24 孔板内，在37℃条件下培养24h，培养后的的菌悬液分别按10的幂次方稀释并均匀地涂在相应的培养皿上，37℃培养箱放置24h。24h 后取出琼脂板置于凝胶成像系统设备的暗室中拍照。

1.4 生物相容性实验

样品的细胞相容性实验选用人牙龈成纤维细胞（HGFs）进行，使用DMEM·F12 培养基，按照ISO10993.5 中所推荐的材料与浸提介质比例进行材料浸提制备[5]。

1.4.1 细胞培养

液氮中取出细胞并在37℃下解冻，之后在离心机中离心处理5min，转速为1000r/min。去除上清液，用移液枪加入新鲜培养基并吹打使其分散均匀，吸取适量的细胞悬浮液于培养皿中，在37℃的培养箱中培养3 天。

1.4.2 样品浸提液的制备

将灭菌后的不同锌掺杂量的氧化锆粉末按照0µg/ml、50µg/ml、250µg/ml 和500µg/ml 的 粉 体 与 介 质 比 例 浸 泡 在DMED·F12 培养基中。放置24h 后，无菌条件下过滤，取上清浸提液备用。

1.4.3 观察细胞形貌

先将灭菌后的透明玻璃片放在24 孔板中，再将HGFs 接种于孔板中，接种密度为2.5×104cfu/ml，37℃条件下培养24h。之后去除培养液，加入样品浸提液继续培养24h，浸提液浓度为250µg/ml。之后再废弃原培养基，用缓冲液将载有细胞的玻璃片清洗两遍，加入2.5% 戊二醛固定，并放在4℃冰箱内避光保存12h。之后采用不同浓度梯度的乙醇依次脱水处理。再用六亚甲基硅烷/ 乙醇溶液（1:2，2:1 和纯六亚甲基硅烷）处理15min。最后室温下通风干燥，表面喷金后用电子显微镜观察表面细胞形貌。

2 结果与分析

2.1 Zn-ZrO2 粉体的物相及形貌表征

图1 不同含量锌掺杂氧化锆在20o-80o 的XRD 图。

图2 不同含量锌掺杂氧化锆产物的形貌图。

图1 中显示，锌掺杂氧化锆粉体依旧是四方相为主的氧化锆。在锌掺杂氧化锆产物的形貌图2 中可见，不同含量锌掺杂氧化锆粉体都是粒度在几十纳米左右的颗粒，且分散性较差。

2.2 抗菌实验

Zn-ZrO2粉体对大肠杆菌的抗菌结果：

图3 （A）各组锌掺杂氧化锆对大肠杆菌的细菌增殖图；（B）大肠杆菌与样品片共培养24h 后的细菌形貌图；（C）大肠杆菌与样品粉末共培养24h 后的细菌涂板图。

图4 （A）各组锌掺杂氧化锆对金黄色葡萄球菌的细菌增殖图；（B）金黄色葡萄球菌与样品片共培养24h 后的细菌形貌图；（C）金黄色葡萄球菌与样品粉末共培养24h 后的细菌涂板图。

在图3（A）和4（A）细菌增殖图中，未掺锌的氧化锆相比于空白对照组仍具有一定的抗菌性。同时，相比于0%Zn-ZrO2组，1%Zn-ZrO2、1.5%Zn-ZrO2和2%Zn-ZrO2组样品对两种细菌同样显示出了明显的抗菌效果。在3（B）中大肠杆菌的形貌图中可见，锌的掺杂导致大肠杆菌形貌上不同程度的变化。而4（B）中金黄色葡萄球菌同样也出现不同程度的凹陷和破裂现象。表明了锌掺杂氧化锆会破坏细菌结构。在3（C）的细菌涂板实验中，相比于其他组，1.5%Zn-ZrO2组琼脂板中的菌落数最少，空白对照组的菌落数最多，其他组次之。而在4（C）中，同样是空白对照组菌落数最多，0%Zn-ZrO2组次之，但是1%Zn-ZrO2、1.5%Zn-ZrO2和2%Zn-ZrO2组之间的菌落数差异不明显。总之，锌的掺杂会导致氧化锆抗菌性的提高，但是不同掺杂量之间的抗菌性差异还不太明显。

2.3 Zn-ZrO2 生物相容性实验

图5 的细胞形貌图显示，在与细胞共培养24h 后的0%Zn-ZrO2和 1%Zn-ZrO2样品表面上，细胞数量居多且大都铺展开来，而在1.5%Zn-ZrO2组样品中，大量细胞还尚未铺展。在2%Zn-ZrO2组样品中，细胞出现数量明显减少的现象。表明当锌掺杂量过高时，对HGFs 的生长具有一定的抑制作用。

图5 250µg/ml 样品浸提液分别与HGFs 共培养24h 之后的细胞生长图。

3 小结

（1）以六水合硝酸锌为锌源，采用简单的化学沉淀法将其加入到氧化锆的制备过程中，合成了纳米级锌掺杂氧化锆粉体，XRD 数据显示锌掺杂氧化锆仍然是以四方相为主题的材料，且粒径均分布在50nm 左右。

（2）通过改变锌的掺杂量，得到了锌掺杂氧化锆对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌不同程度的抗菌效。

（3）将所合成的锌掺杂氧化锆粉体应用于对HGFs 的生物相容性实验中，从样品表面的细胞生长情况来看，当锌的掺杂量达到1.5% 时，对HGFs 具有明显的抑制作用，当掺杂量为2% 时，细胞数量明显减少。