不同强度运动对自发性高血压大鼠肾脏纤维化的影响及作用机制研究

付常喜 马刚 李平 彭朋

摘    要：對比长期中等强度持续运动（MCE）和高强度间歇运动（HIE）对自发性高血压大鼠（SHR）肾脏纤维化的影响，并探讨胶原代谢通路（合成代谢和分解代谢）在其间的作用机制，研制高血压肾病患者的最佳康复运动处方。方法：45只3月龄雄性SHR随机分为高血压安静组（SHR-S组）、中等强度持续运动组（SHR-M组）、高强度间歇运动组（SHR-H组），同时，将10只Wistar-Kyoto大鼠作为正常血压对照组（WKY组）。WKY组和SHR-S组大鼠在鼠笼内安静饲养，SHR-M组和SHR-H组大鼠分别进行18周相应方式的运动干预。实验后，使用无创血压仪检测尾动脉血压;以血尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）及24 h尿蛋白含量评价肾功能;使用H-E和Masson染色进行肾脏组织病理学观察，并对肾小管间质损伤进行评分以及计算间质胶原容积分数（CVF）;采用Western blot法检测肾脏转化生长因子β1（TGF-β1）、磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）、结缔组织生长因子（CTGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和组织金属蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）蛋白表达量;采用免疫组织化学检测肾脏α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达量。结果：SHR-S组的血压、24 h蛋白尿、BUN、SCr、肾小管间质损伤评分、CVF、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad23、CTGF蛋白表达量、TIMP-1蛋白表达量和肾脏α-SMA表达量均高于WKY组（p<0.05），而MMP-9蛋白表达量和MMP-9/TIMP-1比值均低于WKY组（p<0.05）;SHR-M组的血压、24 h蛋白尿、BUN、SCr、肾小管间质损伤评分、CVF、TGF-β1、p-Smad2/3、CTGF蛋白表达量、TIMP-1蛋白表达量和肾脏α-SMA表达量均低于SHR-S组（p<0.05），而MMP-9蛋白表达量和MMP-9/TIMP-1比值均高于SHR-S组（p<0.05）;SHR-H组的肾小管间质损伤评分和CVF均高于SHR-S组（p<0.05），但是血压、肾功能、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、CTGF蛋白表达量及肾脏α-SMA表达量相较SHR-S组均无显著差异（p>0.05）;SHR-H组的血压、肾功能、肾小管间质损伤评分、CVF、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、CTGF蛋白表达量、肾脏α-SMA表达量均高于SHR-M组（p<0.05），而MMP-9蛋白表达量、TIMP-1蛋白表达量和MMP-9/TIMP-1比值均低于SHR-M组（p<0.05）。结论：长期中等强度持续运动通过维持胶原代谢稳态（即促进降解并降低合成）及抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞分化而减轻自发性高血压大鼠肾脏纤维化并改善肾功能;长期高强度间歇运动则进一步破坏胶原稳态平衡（抑制胶原降解，但对胶原合成无影响）加重自发性高血压大鼠肾脏纤维化，但并未引起成纤维细胞转化及肾功能继续恶化。因此，中等强度持续运动仍然是高血压肾病患者康复的最佳运动方式，长期高强度间歇运动对高血压肾病患者的安全性和有效性有待进一步研究。

关键词：中等强度持续运动;高强度间歇运动;高血压肾病;肾脏纤维化;细胞外基质;胶原代谢

中图分类号：G 804.5          学科代码：040302           文献标识码：A

Abstract：To analyze the effects of long-term moderate intensity continuous exercise（MCE） and high intensity interval exercise （HIE） on renal fibrosis in spontaneously hypertensive rats （SHR） and the possible mechanism of collagen metabolic pathway （anabolism and catabolism）， so as to develop the optimal exercise rehabilitation prescription for patients of hypertensive nephropathy. Methods： Forty-five 3-month-old male SHR were randomly divided into sedentary （SHR-S）， MCE （SHR-M） or HIE （SHR-HIE） groups， at mean time， 10 Wistar-Kyoto（WKY） were used as normotensive group. Rats of WKY and SHR-R groups kept quietly at cage while those of SHR-M and SHR-H groups performed corresponding mode of exercise intervention for 18 weeks. After experiment， caudal artery blood pressure was measured by non-invasive blood pressure tester; renal function was tested by blood urea nitrogen （BUN）， serum creatinine （SCr） and 24 h urine protein; renal histopathological observation was conducted by HE and Masson’s staining to grade renal tubule interstitial injury and interstitial collagen volume fraction（CVF） respectively; protein expression of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， phosphorylation of Smad2/3 （p-Smad2/3）， connective tissue growth factor （CTGF）， matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） and tissue inhibitors of metalloproteinase-1 （TIMP-1） was tested by Western blot; the expression of α-smooth muscle actin （α-SMA） was tested through immunohistochemistry. Results： Blood pressure， 24 h urine protein， BUN， SCr， renal tubule interstitial injury score， CVF， TGF-β1， p-Smad2， p-Smad23， CTGF protein expression， TIMP-1 protein expression and kidney α-SMA expression were higher（p<0.05）， while MMP-9 protein expression and MMP-9/TIMP-1 ratio were lower （p<0.05） in SHR-S group than WKY group; blood pressure， 24 h urine protein， BUN， SCr， renal tubule interstitial injury score， CVF， TGF-β1， p-Smad2/3， CTGF protein expression， TIMP-1 protein expression and kidney α-SMA were lower （p<0.05）， while MMP-9 protein expression and MMP-9/TIMP-1 ratio were both higher （p<0.05） in SHR-M group than SHR-S group; renal tubule interstitial injury score and CVF were both higher （p<0.05） than SHR-S group， but blood pressure， renal function， protein of TGF-β1， p-Smad2， p-Smad3， CTGF protein expression and kidney α-SMA were no significantly different （p>0.05） in SHR-H group; blood pressure， renal function， renal tubule interstitial injury score， CVF， TGF-β1， p-Smad2， p-Smad3 and kidney α-SMA expression were higher （p<0.05）， while MMP-9 protein expression， TIMP-1 protein expression and MMP-9/TIMP-1 ratio were lower （p<0.05） in SHR-H group than SHR-M group. Conclusions： Long-term MCE alleviated renal fibrosis of SHR through maintenance of collagen metabolism homeostasis （promoted degradation and reduced synthesis） as well as inhibition of differentiation of fibroblasts into myofibroblasts; however， long-term HIE exacerbated renal fibrosis in spontaneously hypertensive rats by further destruction of collagen homeostasis （suppressed collagen degradation， but had no effect on collagen synthesis） but failed to induce phenotype transformation of fibroblasts and subsequent renal dysfunction. Therefore， MCE is still the optimal exercise rehabilitation modality for patients of hypertensive nephropathy， although the safety and efficacy of long-term HIE to patients with hypertensive nephropathy should be further confirmed.

Keywords：moderate-intensity continuous exercise; high-intensity interval exercise; hypertensive nephropathy; renal fibrosis; extracellular matrix; collagen metabolism

慢性肾脏疾病（chronic renal disease，CKD）是各种原因引起的慢性肾脏结构和功能障碍，其中高血压是继发性CKD首要病因（肾小球肾炎则是原发性CKD的主要原因），即高血压肾病[1]。CKD恶化的主要特征是肾实质细胞缺失，取而代之的是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）。ECM的主要成分是胶原，由于胶原代谢平衡稳态失调（即合成增加、降解减少）以及成纤维细胞向成肌纤维细胞表型转化，进而引起ECM过度沉积以致肾脏纤维化，后者是所有CKD发展到肾功能衰竭的共同特征以及终末期肾病的共同病理特点[2]。分子生物学研究证实，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）/组织金属蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）[3]和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）-Smad2/3[4]分别是调节胶原分解与合成代谢的主要调控因子。MMPs催化ECM降解，同时TIMPs能够抑制MMPs活性，以防止ECM过度降解[3]。患高血压肾病时，MMP-9和TIMP-1表达异常造成MMP-9/TIMP-1稳态失衡，进而促进纤维化[5]。TGF-β1通过磷酸化胞浆中的Smad2和Smad3，继之上调多种促纤维化因子，例如结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）基因表达，同时还能促进成纤维细胞表型转化、上调TIMPs而间接抑制MMPs的活性，最终导致肾脏纤维化[6]。高血压大鼠肾小球和肾小管间质细胞中的TGF-β1及其下游效应分子表达量均显著增加[7]。多项研究表明[3-4]，MMP-9/TIMP-1稳态失衡（胶原分解减少）以及TGF-β1-Smad2/3信号持续激活（胶原合成增加）是各种病因引起肾脏纤维化的主要分子生物学机制，调控上述信号途径成为防治肾脏纤维化的重要靶点。

运动疗法是高血压患者非药物治疗的主要手段，能够降低血压、改善多种心血管危险因素、防治并发症、提高生活质量并降低住院率与死亡率[8]。中等强度持续运动（moderate intensity continuous exercise，MCE）（简称有氧运动，下同）是高血压患者康复疗法的主要形式，其对肾脏的作用包括增加肾血流量、减轻氧化应激和炎症反应、降低尿蛋白量并改善肾功能，因此同样适用于高血压肾病患者[9-14]。高强度间歇训练（high intensity interval exercise，HIE）是近年来新兴的一种运动模式，相对于传统的MCE具有时效性、趣味性等突出特点[15-16]，其对运动员以及普通健康人群生理机能、运动能力的改善作用较为肯定，但对心血管疾病的健康效应尚有争议[17-21]。课题组前期的研究发现，MCE能够抑制自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）病理性心脏肥大以及心肌纤维化[18]，短期（8周）HIE的效果与MCE相似，而长期（18周）HIE却会加重心脏重塑并加速心力衰竭进程[20]，说明HIE对病理状态下心脏的良性作用可能存在“一过性/暂时性”特征。HIE对高血压肾病的作用则鲜有学者关注，最近一项针对CKD患者（n=14）的随机对照实验表明[22]，短期（3次/周，共12周）HIE和MCE均可改善心肺功能、促进骨骼肌蛋白合成、减轻临床症状（疲劳、呼吸困难、嗜睡等），且无不良反应发生，初步证实了HIE的可行性、安全性和有效性。但长期HIE对肾脏纤维化的影响及机制尚不明确。因此，本研究以SHR为动物模型，对比长期（18周，相当于人类运动10年）不同强度运动（MCE vs HIE）对肾脏纤维化的影响并探讨胶原代谢通路（合成代谢和分解代谢）在其中的作用机理，探讨高血压肾病患者的最佳康复运动处方。本研究假设长期MCE和HIE均可抑制SHR肾脏纤维化并改善肾功能，其中以HIE的作用更为显著。

1   研究对象与方法

1.1  实验对象与分组

10只Wistar-Kyoto大鼠以及45只3月龄雄性SHR，体质量为（213±15）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2018-0027。将SHR按照随机数字表分为高血压安静组（SHR sedentary，SHR-S组）（n=15）、MCE组（SHR-M组）（n=15）和HIE组（SHR-H组）（n=15），10只Wistar-Kyoto大鼠作为正常血压对照组（WKY组）（n=10）。大鼠饲养环境：温度24～26℃，湿度为50%～60%，12：12 h明暗周期，分笼（5只/笼）标准饲料饲养，自由进食水。WKY组和SHR-S组大鼠在鼠笼内安静饲养，SHR-M、SHR-H组分别进行18周持续跑台训练和间歇跑台训练。

1.2  运动方案

所有大鼠先进行5 d适应性训练，运动方式：跑台（段氏DSPT-208型，安徽正华生物仪器设备有限公司）持续运动，强度：10～15 m/min，坡度：0°，时间：20～30 min/d。随后按照课题组既往建立的递增负荷力竭运动实验测试大鼠最快跑速（maximal velocity，Vmax）[18，20]：起始负荷为5 m/min，每隔2 min增加1.5 m/min（坡度始終为0°），直至力竭，记录最后一级负荷对应的跑速即为Vmax。

Vmax测试后休息2 d，随后SHR-M组和SHR-H组分别进行18周不同方式的运动，负荷（包括训练强度、持续时间、完成组数以及每周频率）随时间逐渐递增，具体方案见表1。分别于第4、8、12和16周重新测定Vmax以及时调整训练强度（跑速）[20]。

1.3  尾动脉血压测量

末次训练后48 h，采用智能无创血压测量仪（BP-2010E，日本Softron公司）测量尾动脉血压。大鼠处于清醒、安静状态下，尾部加温后将传感器置于尾根部监测血流量变化，当脉冲波形稳定（即大鼠处于稳定状态）时自动测量血压，重复3次，取均值。指标包括收缩压（SBP）、舒张压（DBP），计算平均动脉压（MAP）;MAP=（SBP+DBP×2）/3。

1.4  尿液、血液标本采集以及肾脏组织取材

尾动脉血压测量后禁食，自由饮水。用代谢笼（Columbus CLAMS，美国Columbus公司生产）收集大鼠24 h尿液，并将2 mL装入离心管中。大鼠称量体质量后用10%水合氯醛（剂量：0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉并固定，腹主动脉取血5 mL，离心取血清。分离左侧肾脏和肾上腺以及胸腺，迅速在冷生理盐水中洗涤，滤纸吸干水分后分别称重（mg）并计算与体质量（g）的比值作为肾脏质量指数、肾上腺质量指数和胸腺质量指数，其中肾上腺质量指数和胸腺质量指数用于检测是否发生肾上腺肥大和胸腺萎缩，并作为慢性应激指标。取约1 cm3肾脏组织用于组织病理学观察，其余肾脏组织用锡纸包裹迅速放至-80℃低温冰箱冻存，待測各蛋白表达量。

1.5  肾功能检测

采用光栅分光光度计（722 型，上海分析仪器厂）以双缩脲法检测尿液样本24 h尿蛋白含量，生化分析仪（AU680，美国Bachman公司制造）以酶法检测血尿素氮（BUN）及血清肌酐（SCr）含量。严格按照试剂盒（均购自武汉博士德生物工程有限公司）说明进行操作，重复3次，取均值。

1.6  肾脏病理组织学观察

将肾脏组织用多聚甲醛溶液浸泡24 h，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，利用病理切片机（RM2255，德国LEICA公司制造）制备 4 μm 厚切片。脱腊后分别进行苏木素-伊红（H-E）染色和Masson染色，中性树胶封片。每只大鼠取3张切片，每张切片随机选取10个高倍（×400）显微镜（IX71型，日本OLYMPUS公司制造）下观察到的肾脏组织病理形态改变情况。H-E染色观察肾小管间质损伤情况（是否存在肾小管坏死，肾小管扩张、萎缩，炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞水肿以及肾小管管型）并进行肾小管间质损伤评分。按照损伤程度由轻度到严重评分为0～4分[23]：0分，正常肾脏;1分，损伤<25%;2分，损伤占25%～50%;3分，损伤占50～75%;4分，损伤>75%。由3名经验丰富的病理科医师分别进行观察并取均值。Masson染色后用图像分析软件（Image Pro Plus 6.0，美国Media Cybernetics公司研发）测量切片中结缔组织面积与所观测面积的比值作为间质胶原容积分数（CVF）。

1.7  Western Blot检测法

Western Blot法检测肾脏TGF-β1（Santa cruz公司研发，稀释比为1∶1 000）、Smad2（Abcam公司研发，稀释比为1∶2 000）、Smad3（Abcam公司研发，稀释比为1∶2 000）、磷酸化Smad2（p-Smad2）（Abcam公司研发，稀释比为1∶1 000）、磷酸化Smad3（p-Smad3）（Abcam公司研发，稀释比为1∶1 000）、CTGF（Abcam公司研发，稀释比为1∶2 000）、MMP-9（Santa cruz公司研发，稀释比为1∶1 000）和TIMP-1（Santa cruz公司研发，稀释比为1∶2 000）蛋白表达量。取适量肾脏组织匀浆后提取总蛋白，用考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度。取100  μg蛋白样品在垂直电泳仪上经SDS-PAGE分离，随后转移至PVDF膜上。4 ℃静置孵育过夜，二抗（武汉博士德生物工程有限公司，1∶5 000）37 ℃孵育2 h。充分洗涤后，ECL发光成像，扫描各条带灰度值。内参蛋白为β-actin（Santa cruz公司研发，稀释比为1∶10 000），将目的蛋白灰度值与β-actin的比值作为相对表达量，计算各组各蛋白相对表达量与WKY组的比值作为相对表达率。

1.8  免疫组织化学分析

免疫组织化学分析肾脏α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达量。石蜡切片脱蜡、水化，胃蛋白酶修复抗原 30 min。加入α-SMA一抗（Abcam公司研发，稀释比为1∶250）封闭，4 ℃过夜。PBS洗涤后加二抗（武汉博士德生物工程有限公司研发，1∶500）孵育 20 min，DAB显色，苏木素轻度复染1～2 min，充分冲洗反蓝，常规脱水、透明、封片。光镜（仪器型号、产地同1.6）下观察α-SMA 分布并进行半定量积分评定。

1.9  统计学处理与分析

使用“SPSS 20.0 for Windows”软件包对数据进行统计学处理与分析。所有数据用“均数±标准差”表示。各参数组间比较采用单因素方差分析，若F检验具有统计学意义（p<0.05），则多重比较采用LSD检验。显著性水平定为α=0.05。

2   研究结果

2.1  样本量分析

实验过程中，SHR-S组、SHR-M组和SHR-H组的大鼠分别死亡3只、1只和4只，SHR-M组和SHR-H组各有2只拒跑，因此，最终纳入统计的样本量n=43，各组样本量分别为：WKY组（n=10）、SHR-S组（n=12）、SHR-M组（n=12）和SHR-H组（n=9）。

2.2  体质量和肾脏指数的变化

SHR-S组的肾脏质量和肾脏质量指数高于WKY组（p<0.05）;SHR-M组的体质量、肾脏质量和肾脏质量指数低于SHR-S组（p<0.05）;SHR-H组的体质量低于SHR-S组（p<0.05），肾脏质量和肾脏质量指数高于SHR-M组（p<0.05）（见表2）。

2.3  肾上腺质量指数和胸腺质量指数的变化

SHR-S组的肾上腺质量指数高于WKY组（p<0.05）、胸腺质量指数低于WKY组（p<0.05）;SHR-M组的肾上腺质量指数低于SHR-S组（p<0.05）、胸腺质量指数高于SHR-S组（p<0.05）;SHR-H组的肾上腺质量指数高于SHR-S和SHR-M组（p<0.05）、胸腺质量指数低于SHR-S组和SHR-M组（p<0.05）（见图1）。

2.4  动脉血压的变化

SHR-S组的SBP、DBP和MAP均高于WKY组（p<0.05）;SHR-M组的SBP、DBP和MAP低于SHR-S组（p<0.05）;SHR-H组的各血压值高于SHR-M组（p<0.05），但相较SHR-S组无显著性差异（p>0.05，见图2）。

2.5  肾功能的变化

SHR-S组的24 h蛋白尿、BUN和SCr均高于WKY组（p<0.05）;SHR-M组的24 h蛋白尿、BUN和SCr均低于SHR-S组（p<0.05）;SHR-H組的肾功能各参数高于SHR-M组（p<0.05），但相较SHR-S组均无显著性差异（p>0.05，见图3）。

2.6  肾脏病理组织学分析

HE染色显示胞浆呈红色，胞核呈蓝色。WKY组的肾小球、肾小管结构清晰完整，无明显病理改变，肾小管间质损伤评分为0;SHR-S组的肾小球基底膜增厚，肾小囊腔扩张，血管球与囊腔壁界限不明显，空泡变性，肾小管上皮细胞水肿坏死，管腔扩张，间质增厚，出现各种管型，肾小管间质损伤评分明显高于WKY组（p<0.05）;SHR-M组仍存在肾小球基底膜稍厚，肾小囊腔稍增大，部分血管球与囊腔壁界限不清晰，肾管上皮细胞水肿以及管腔扩张，但程度有所减轻，肾小管间质损伤评分低于SHR-S组（p<0.05）;SHR-H组的病理改变进一步加重，肾小管间质损伤评分高于SHR-S组和SHR-M组（p<0.05）。肾小管间质损伤评分见图4。

Masson 染色显示胶原纤维呈蓝色。WKY 组间质胶原分布稀疏，着色较淡;SHR-S组的肾小球、肾小管周围组织排列紊乱且蓝色深染胶原纤维增多，CVF高于WKY组（p<0.05）;SHR-M组的纤维化程度减轻，CVF较SHR-S组下降（p<0.05）;SHR-H组的纤维化进一步加重，CVF高于SHR-S和SHR-M组（p<0.05）。肾脏CVF的变化见图5。

2.7  肾脏TGF-β1-Smad2/3信号途径各蛋白表达量的变化

SHR-S组的TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和CTGF蛋白表达量高于WKY组（p<0.05）;SHR-M组的TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和CTGF蛋白表达量低于SHR-S组（p<0.05）;SHR-H组上述蛋白表达量均高于SHR-M组（p<0.05），但相较SHR-S组均无显著性差异（p>0.05）。各组的Smad2和Smad3蛋白表达量均无显著性差异（p>0.05，见图6）。

2.8  肾脏MMP-9/TIMP-1平衡稳态的变化

SHR-S组的TIMP-1蛋白表达量高于WKY组（p<0.05），MMP-9蛋白表达量以及MMP-9/TIMP-1值低于WKY组（p<0.05）;SHR-M组的TIMP-1蛋白表达量低于SHR-S组（p<0.05），MMP-9蛋白表达量以及MMP-9/TIMP-1值高于SHR-S组（p<0.05）;SHR-H组各指标均低于SHR-S组和SHR-M组（p<0.05）。见图7。

2.9  肾脏α-SMA蛋白表达量的变化

免疫组织化学分析结果显示，阳性部位为棕黄色，细胞核呈淡蓝色。WKY组仅见肾动脉血管平滑肌细胞内蛋白α-SMA呈阳性表达，肾小管上皮细胞以及肾间质表达呈阴性;与WKY组比较，SHR-S组除肾动脉血管平滑肌阳性表达外，肾小管上皮细胞胞浆及肾间质中可见α-SMA呈强阳性表达，其半定量积分高于WKY组（p<0.05）;SHR-M组的肾组织中α-SMA表达明显减少，半定量积分低于SHR-S组（p<0.05）;SHR-H组的α-SMA表达量与SHR-S组无显著性差异（p>0.05），但高于SHR-M组（p<0.05）。α-SMA蛋白表达量的变化见图8。

3   讨论

本研究旨在探讨长期（18周，相当于人类运动10年）不同强度运动对高血压肾病大鼠肾脏纤维化的影响及机制。结果发现，MCE后TGF-β1-Smad2/3信号通路得到抑制，MMP-9/TIMP-1平衡稳态改善，α-SMA蛋白表达量减少，肾脏纤维化程度减轻，肾小管间质损伤评分下降，肾功能增强，这说明MCE降低胶原合成并促进其降解进而维持胶原代谢稳态，同时抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞分化而减轻SHR肾脏纤维化;然而HIE后，MMP-9/TIMP-1稳态失衡进一步破坏，肾脏纤维化程度加剧，肾小管间质损伤评分增加，但TGF-β1-Smad2/3信号途径、α-SMA蛋白表达量以及肾功能并无改变，这说明HIE通过抑制胶原降解（但对胶原合成无影响）加重了SHR肾脏纤维化，但未引起成纤维细胞表型转化及肾功能继续恶化。总之，本研究结果部分证实了研究假设，因此，目前MCE仍然是高血压肾病患者的最佳运动康复方式，长期HIE的安全性和有效性尚需更多实证支持。

3.1  长期MCE和HIE对SHR肾脏纤维化的影响

CKD的主要病理学改变为肾炎、肾小球硬化、肾小管间质纤维化[1]。本研究成功复制高血压肾病模型，组织病理学观察发现，SHR-S组大鼠肾内小动脉透明变性（硬化）、管腔狭窄、肾实质破坏、炎症浸润、血管周以及间质胶原大量沉积，肾小管间质损伤评分增高，这是由于长期血压升高，阻力血管病变不断发展，造成肾内小动脉受累使肾脏发生缺血性损伤并导致肾脏纤维化[1]，同时24 h尿蛋白、BUN和SCr含量显著增加，肾功能进行性恶化。

规律运动尤其是MCE对多种病因诱发的组织纤维化（心肌纤维化、血管纤维化、肝纤维化、肺纤维化等）均具有改善效应[24]。有动物模型证实，MCE（例如：游泳、跑台等方式[25-29]）以及中等强度抗阻训练[30-31]均能够延缓CKD大鼠肾脏纤维化进程，这在本研究中也得到佐证，即SHR-M组的CVF和肾小管间质损伤评分相较SHR-S组下降、肾功能改善，说明中等强度多种方式运动均可对肾脏起到保护作用。Choi等[32]的研究还发现，有氧运动能够减少增龄引起的胶原交联，因此MCE对胶原含量和空间结构均具有有益作用。由于血压升高是高血压肾病的主要原因，所以血压下降在MCE组肾脏结构与功能改善中起关键作用。此外，有氧运动还能通过神经体液途径以及促进肌肉释放肌肉因子并靶向作用于远隔器官等方式对肾脏起到保护作用[33]。

HIE是近年来大众健身中新兴的训练模式，相对于MCE方式具有明显的时效性特征，能够改善多种慢性病患者器官功能和临床症状，延缓疾病发展并提高生活质量。长期HIE对CKD的效果理应优于MCE，然而本研究却发现，经过18周HIE后，SHR-H组的CVF和肾小管间质损伤评分相较SHR-S组进一步提高，说明HIE加重了SHR肾脏纤维化，推测与运动负荷过大有关。有研究证实[34]，肾脏缺血-再灌注（运动期缺血、恢复期再灌注）以及运动性横纹肌溶解症（肌肉损伤时释放的肌红蛋白损伤肾小管）是高强度剧烈运动诱导肾脏损伤的重要原因[34]。一次急性高强度运动诱导组织器官发生一过性损伤，若及时调整训练负荷并采取恢复手段（营养、休息等）后可逆转，但持续高负荷运动造成机体无法完全恢复，其长期的积累效应则会导致肾脏结构与功能异常。此外，反复高强度运动对于实验动物而言是一种不良应激源[35]，致使SHR长期处于应激状态并发生应激性损伤而加重疾病，本研究中SHR-H组出现肾上腺肥大和胸腺萎缩（应激标志物）也间接证实了这一推断。维持ECM穩态是肾脏胶原代谢平衡的关键机制，高强度运动通过诱导ECM稳态失衡最终加重SHR肾脏纤维化（详见3.2和3.3）。然而值得注意的是，HIE在加重SHR肾脏纤维化的同时肾功能并未进一步恶化，这与Aparicio等[36]对健康SD大鼠进行12周高强度抗阻训练的研究结果一致，其原因有四。第一，肾脏具有强大的代偿能力，在肾脏损伤不超过75%时，残存的肾组织仍可维持正常生理机能，同时各模型组动物可能并未发展至肾衰阶段;第二，持续血压升高是高血压肾病的根本原因，SHR-H组的血压未发生显著性变化可能是肾功能无变化的重要机制之一;第三，高血压大鼠已出现蛋白尿、BUN和SCr的显著升高（约3～4倍），进行高强度运动可能并不能进一步增加其含量;第四，即使高强度运动可造成蛋白尿与BUN暂时性增加，但本研究的取材点在末次训练后48 h，可能错过了蛋白尿与BUN的升高相。总之，运动负荷过大诱导机体适应不良是HIE加重SHR肾脏损伤的主要原因，同时也说明，MCE仍然是高血压肾病患者运动康复的最佳方式。

3.2  长期MCE和HIE对ECM代谢信号通路的影响

ECM代谢稳态平衡是胶原含量以及肾脏组织是否发生纤维化的决定因素[37]。在本研究中，SHR-S组的TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF蛋白表达量相较WKY组明显增加，说明介导胶原合成的TGF-β1-Smad信号活化。另一方面，MMP-9表达量减少而TIMP-1增加，即TIMP-1对MMP-9的抑制增强，胶原分解速度减缓。总之，SHR肾脏纤维化是胶原合成增加以及降解减少导致的。

经过18周训练后，SHR-M组的TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF下降，说明胶原合成减少。本研究还发现，与SHR-S组比较，SHR-M组的MMP-9表达量增加，而TIMP-1表达量减少，表明TIMP-1对MMP-9的抑制作用得到解除，胶原降解增加，这与Kwak等[38]针对衰老大鼠的研究结果一致。由于TGF-β1还能够通过上调TIMPs表达量而抑制MMPs活性[39]，故MCE下调TGF-β1对胶原降解起间接促进作用。总之，MCE改善SHR肾脏纤维化是胶原降解增加以及合成减少共同作用的结果，而TGF-β1-p-Smad2/3和MMP-9/TIMP-1则是有氧运动发挥肾脏保护效应的关键靶点。然而18周HIE后，TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF表达量与SHR-S组并无显著性差异，说明长期HIE对胶原合成并无作用。这与Benito等[40]的研究不同，该研究发现，长期高强度运动诱导健康大鼠心肌纤维化，同时伴TGF-β1表达量增加，可能与动物模型（SHR vs. 健康大鼠）、组织类型（肾脏 vs 心脏）以及运动方式（HIE vs 持续高强度运动）等因素有关。值得注意的是，本研究还发现，SHR-HIE组的TIMP-1和MMP-9蛋白表达量较SHR-S组有所减少，似乎说明TIMP-1对MMP-9的抑制效应减弱。然而Yang等[41]的研究进一步显示，MMPs与TIMPs之间的动态平衡（用两者的比值表示）是胶原分解代谢的决定因素。本研究中SHR-HIE组的MMP-9/TIMP-1比值变小，说明TIMP-1对MMP-9的抑制作用进一步增强，胶原降解减少。因此，长期HIE通过抑制胶原降解而加重肾脏纤维化，但对胶原合成并无显著影响。

3.3  长期MCE和HIE对成纤维细胞转化的影响

成纤维细胞是肾脏中的主要间质细胞，在病理状态下，成纤维细胞增殖并分化为成肌纤维细胞，后者合成胶原蛋白的量是前者的5倍。α-SMA蛋白表达量是成纤维细胞向成肌纤维细胞转化的特异性标志物。组织纤维化根据有无细胞缺失和坏死分为反应性纤维化和替代性纤维化两种类型[42]，前者胶原异常增多并沉积在细胞间质与血管周围，但无明显实质细胞缺失和坏死，α-SMA蛋白表达量无明显变化，通过一定的干预手段可得到改善甚至逆转，而替代性纤维化则存在大量实质细胞坏死，同时伴有α-SMA明显增加，该类型无法逆转。

在本研究中，MCE能够部分阻止SHR诱导的α-SMA表达量增加，表明MCE可抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞分化，进一步改善胶原代谢稳态;然而HIE虽然加重肾脏纤维化，但α-SMA表达量却并未较SHR-S组进一步增加，说明高强度运动诱导的肾脏纤维化不存在成纤维细胞表型转化，故属于反应性纤维化类型。TGF-β1的作用广泛，除能够促进胶原合成外，还可诱导成纤维细胞向成肌纤维细胞表型转化，因此，HIE未进一步激活TGF-β1可能是α-SMA表达量无显著性变化的原因之一。Aschar-Sorbbi等[43]同样发现，小鼠6周高强度运动后成纤维细胞数量显著增加，但成肌纤维细胞数量并未增加。Benito等[40]针对心脏组织的研究证实，长期高强度运动诱导心肌纤维化，后者在停训8周后完全逆转。据此推断，本研究SHR-H组大鼠若及时停训或将运动强度降低并辅以其他治疗手段，其肾脏纤维化严重程度将得以缓解。因此，在高血压肾病患者运动康复期间监测α-SMA的变化有助于评价运动效果并及时调整运动方案，以确保运动的安全性和有效性。

4   结论与建议

长期MCE通过维持胶原代谢稳态（即促进降解并降低合成）以及抑制成纤维细胞向成肌纤维细胞分化而减轻SHR肾脏纤维化并改善肾功能;长期HIE则进一步破坏胶原稳态平衡（抑制胶原降解，但对胶原合成无影响）加重SHR肾脏纤维化，其机制可能与高强度运动诱导的应激反应有关，然而由于HIE并未造成成纤维细胞转化以及肾功能继续恶化，故属于反应性纤维化且可能具有可逆性。

本研究结果至少说明，HIE并非适用于任何人群，或者针对不同人群存在最佳的HIE方案，心血管疾病患者尤其是体适能水平较低者采用HIE方案应持谨慎态度，运动中应加强医务监督，根据身体机能状态循序渐进地调整运动负荷。今后的研究应进一步探索不同人群实施HIE的安全性和有效性，对其进行运动风险评估并优化运动方案。因此，目前MCE仍然是高血壓肾病患者运动康复的最佳方式，长期HIE的健康效应有待更多实证支撑。

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