枸杞多糖的抗氧化作用在眼科的研究现状

栗蓥，寇列玲，沈兰珂

枸杞子，性味甘平，归肝、肾两经，具有滋补肝肾、益精明目的功效，为药食两用之品。中医古籍对于枸杞子的首次记载出现于《神农本草经》[1]。自此以后历代医家对于枸杞子的性味归经、功效主治等方面都有了很多论述和探究[2]。随着科学技术的不断发展，现代医学工作者从枸杞子中分离了很多种活性成分，如枸杞多糖（lycium bararum polysaccharides，LBP）、枸杞黄酮、枸杞色素、类萝卜素等。目前对于眼部疾病来说最有效的成分是LBP 和类胡萝卜素[3-4]。LBP 是从枸杞的干燥成熟果实中经过脱脂、水提、反复醇沉所得，是目前枸杞子的生物结构中最重要的成分之一，也是一种天然的抗氧化剂。本文将对LBP 抗氧化机制在眼科诸多疾病中的作用进行整合综述，从而为LBP 及其他相关物质对眼科疾病的进一步研究和临床应用提供一定的理论依据。

1 LBP 的抗氧化机制

机体在与外界不断接触的过程中，由于自然环境的污染、放射线照射等外界因素以及机体自身代谢因素都会使机体产生自由基。一般来说自由基的产生量与其清除量长期处于一种相对平衡的状态，这种平衡的状态有利于维持人体正常的生命活动。但是在某些异常情况下，当自由基的产生量超过其清除量时就会打破这一稳态，即为氧化应激（oxidative stress，OS）。OS 会对人体的免疫系统、神经系统等各方面产生严重的影响而导致多种疾病的发生[5]。眼球作为一个视觉器官，长期接受光刺激且部分暴露于外界环境，在机体内环境发生变化时极易出现氧化损伤，所以OS 与多种眼科疾病的发生发展均有着密切联系[6-7]。通过提高机体抗氧化能力能够在一定程度上对这些疾病起到预防及治疗作用，所以寻找安全有效的抗氧化药物对眼科疾病的防治尤为重要。LBP 的抗氧化作用是通过直接清除自由基、提高抗氧化酶活性以及调控凋亡相关基因表达等多方面实现的[8]。

1.1 直接清除自由基，防止过氧化反应

活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）是机体自身在代谢过程中所产生的一种活性成分，包括超氧阴离子（superoxide radical，O2-）、羟自由基（hydroxyl free radical，-OH）以及过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）。适量的ROS 既可以作为第二信使分子促进正常的细胞分裂增殖、组织更新、介导细胞内信号的传导，还可以清除体内的病原体，对维持机体的正常生理活动有着重要作用。但是过量的ROS 会导致脂质过氧化、DNA 断裂以及蛋白质变性等损害而发生过氧化反应，致使细胞损伤和疾病的发生[9]。Zhang 等[10]在LBP 的体外抗氧化活性实验中采用紫外分光光度法测定其清除自由基的能力，实验结果表明，LBP 在一定程度上能够清除O2-、-OH、二苯代苦味酰基（1,1-diphenyl-2-picryl-hydyazyl，DPPH）自由基和ABTs 自由基，并且其清除能力与LBP 的浓度呈正相关，但是当浓度达到一定值时清除率达到平稳的状态则不再随着浓度的增加而提高。

1.2 提高抗氧化酶活性，减少脂质过氧化物产生

抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等，可以减缓机体的氧化速度。GSH-Px 是机体内广泛存在的一种过氧化物分解酶，它可以将有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，是判断机体抗过氧化能力的重要指标之一[11]。SOD 是一类重要的氧化剂、清除剂，它可以催化超氧化物转化为氧气（O2）和H2O2，具有抵抗OS 的作用[12]。CAT 的抗氧化作用主要是通过催化分解H2O2生成H2O 和O2来实现的。这三种抗氧化酶均能够清除组织中的过氧化物，降低氧化损伤对机体的伤害程度。LBP可以通过激活这些抗氧化酶来提高机体的抗氧化水平。Li 等[13]使用SD 大鼠，通过一次性腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（50 mg/kg）构建糖尿病动物模型，实验组给予LBP饮水喂养30 d，相较于对照组，其MDA 水平降低，SOD、CAT、GST 和GPx 酶活性提高，由此可见机体的抗氧化能力增强。

1.3 调控凋亡基因表达，减轻氧化损伤

细胞凋亡是氧化损伤过程中的一个重要环节。B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/likenia-2，Bcl-2）是目前已知最强的凋亡抑制因子，可以阻碍凋亡基因信号的传递。B 细胞淋巴瘤-2 关联性X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）则属于促凋亡因子，可以促进凋亡基因信号的传递[14]。LBP 可通过调控凋亡途径中相关基因的表达来发挥其抗氧化作用，通过上调Bcl-2 的表达和减少Bax 的表达以达到降低ROS 产生、提高抗氧化酶活性及纠正线粒体膜电位的作用，从而减轻机体氧化损伤[15]。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）家族也是凋亡的重要参与者，其中caspase-3 是其下游最关键的蛋白酶，是凋亡进入不可逆阶段的标志。王海彬等[16]使用STZ 构建大鼠糖尿病模型研究糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）时 发 现，LBP 能 增 加Bcl-2 的 表 达 和 降 低Bax、caspase-3 的表达，从而抑制视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）凋亡。

2 LBP 与眼科疾病

2.1 LBP 与年龄相关性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是黄斑的衰老性改变，好发于50 岁及以上的中老年人，呈进行性发展，可导致单眼或双眼部分甚至完全性视力丧失，是老年人视力丧失的主要原因。其早期特征为玻璃膜疣（drusen）和视网膜色素上皮（retina pigment epithelium，RPE）细胞的改变。其确切病因尚不明确，可能与遗传因素、环境影响、视网膜慢性光损伤、营养失调、代谢障碍等有关[17]。在此之前已有研究[18]表明，OS 作用在AMD 的形成发展中至关重要。

RPE 细胞可以通过吸收多余的光从而防止视网膜受到光诱导损伤[19]，因此在视网膜光损伤的过程中RPE 细胞最先出现损伤最终导致AMD，二者密切相关[20]，所以常构建RPE 细胞光损伤模型用来研究AMD。黄洁等[21]利用（16500±200）Lux 的LED 冷光灯光照细胞12 h，体外培养人RPE 细胞株（ARPE-19）建立光损伤模型，使用不同剂量的LBP 对细胞模型进行处理后发现，LBP 高、低剂量组较对照组SOD 表达增高和ROS、MDA 表达降低，说明LBP 可以增强ARPE 细胞的抗氧化能力，在光诱导损伤时对其起到一定的保护作用。赵芳芳等[22]用原代兔RPE 细胞株体外培养构建细胞光损伤模型，分别用低、中、高不同浓度的LBP 进行干预后发现，LBP可以有效抑制Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3 的表达，并且以LBP 高浓度组的抑制效果最为明显。由此可以看出，LBP 可能通过线粒体信号通路抑制细胞凋亡以减轻机体氧化损伤。

2.2 LBP 与糖尿病视网膜病变

DR 是糖尿病最为常见的眼部并发症。由于持续的高血糖状态使得小血管受到破坏导致视网膜出现微血管瘤、渗出、出血等病理性改变，是一种常见的视网膜微血管病变。

DR 的发病机制可能主要与多元醇代谢通路的异常、蛋白质非酶糖基化产物的堆积、蛋白激酶C（PKC）的活化、血管紧张素转换酶系统的作用等有关[23]。糖尿病患者早期的视网膜病变主要表现在RGCs 的凋亡以及神经胶质细胞的活化[24-25]。由于长期处于高血糖状态，高血糖的毒性不仅能引起视网膜微血管的病变还可以增加ROS 的产生而引起氧化损伤，最终导致DR 的发生，所以OS 在DR 的发病机制中起着至关重要的作用。GUO 等[26]使用LBP 对SD 大鼠DR 模型进行灌胃处理后观察其视网膜超微结构发现，LBP 治疗组大鼠的RGCs、光感受器细胞等未见明显异常，双极细胞和Müller 细胞的胞浆中较DR 模型组仅可见少量、轻度的线粒体改变。由此可见，LBP 可以通过发挥其抗氧化能力明显减轻线粒体的病理改变，阻止神经细胞凋亡。核转录因子NFE2 相关因子（nuclear factor erythroid-2 related factor，Nrf2）是细胞OS 反应中的关键因子，Nrf2 能够与抗氧化反应元件（anti-oxidative response element，ARE）相互作用，诱导抗氧化蛋白的表达，降低ROS 的 水 平[27]。Pan H 等[28]利 用LBP 干 预SD 大 鼠DR 模型，检测体重、血糖、ROS、Nrf2 和血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的蛋白表达，发现LBP 不仅可以使SD 大鼠体重升高、血糖降低，还可以通过激活Nrf2/HO-1 信号通路来降低ROS 的表达。由此可见，LBP 可以改善糖尿病鼠视网膜的OS 状态，有望将其应用于DR 的早期防治。

2.3 LBP 与青光眼

青光眼是以进行性、特征性视神经损害，最终导致视野缺损、视力丧失为特征的一类眼病。它是第1 位不可逆的致盲性眼病，也是全球导致失明的第二大病因[29]。青光眼的发病原因极其复杂，目前研究[30]表明，RGCs 的进行性凋亡及视神经纤维的丢失是青光眼进展的病理基础，而OS 广泛参与青光眼的发生发展。

近年来，H2O2诱导的细胞模型被广泛应用于OS 的各类研究[31]。李贞等[32]用H2O2诱导视网膜神经节细胞-5（retinal ganglion cells-5，RGC-5）建立青光眼模型后使用LBP 进行干预，用DAPI 染色法观察其形态学表现，H2O2组可见典型的细胞凋亡特征：不同程度的染色质固缩、聚集、边缘化，表现为浓染致密的蓝色荧光。而H2O2+LBP 组RGC-5 细胞核基本完整，仅可见少量的细胞染色质浓缩现象，说明LBP 能够保护OS 损伤状态下的RGCs。另一方面，LBP 抑制了Caspase-3、Bax 和c-Myc 的表达，上调了Bcl-2 的表达，从而减少RGCs的凋亡。Liu 等[33]用LBP（0.5 mg/ml）对氯化钴诱导RGC-5 氧化损伤模型进行预处理后发现，LBP 可以通过降低线粒体膜电位和减少活性氧的产生，从而发挥对RGC-5 细胞的保护作用。

2.4 LBP 与视网膜色素变性

视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）是一种最常见的遗传性视网膜疾病，以感光细胞和RPE 共同发生的退行性病变为主要特征。目前，RP 的遗传方式有3 种，主要包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X 连锁隐性遗传，临床上也偶可见散发[34]。在常染色体隐性遗传性RP 基因中与编码磷酸二酯酶6（Pde6）复合体相关的2 个基因突变，即编码磷酸二酯酶6A（Pde6a）和编码磷酸二酯酶6B（Pde6b）是常染色体隐性遗传性RP 的第二常见病因。研究[35]发现，rd 小鼠也是由于Pde6b 基因突变所致，与原发性RP 常染色体隐性遗传病的人类具有同样的基因变异以及相似的基因表型，所以rd 小鼠常用来作为RP 的动物模型。

Wang 等[36]用rd 10 小鼠建立RP 动物模型给予LBP 干预，发现LBP 对小鼠视网膜形态具有保护作用。另外，GSH、氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized，GSSG）的比值（GSH/GSSG）是OS 水平的一个常用检测指标，LBP 可增加GSH/GSSG 的表达以提高机体抗氧化能力[37]。缺氧诱导因子[38]（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）可以激活P53 的转录，从而促进Bax、caspase-3/7 等凋亡蛋白的转录。而LBP 可以使在光感受器变性过程中本来增加的HIF-1α 和caspase-3/7 表达降低，从而延缓光感受器细胞的凋亡。

2.5 LBP 与其他眼科疾病

枸杞子作为一味清肝明目的药材，其多糖提取物对多种眼科疾病皆具有良好的保护作用。刘求红等[39]研究发现，LBP可能通过提高晶状体的抗氧化作用和促进晶状体上皮细胞HSP27 表达来降低糖尿病性白内障大鼠晶状体混浊度，另外还可以改善体重降低和高血糖的情况。LBP 的抗氧化作用对于年龄相关性白内障[40]、急性高眼压症[41]、慢性高眼压症[42]等方面也有一些研究。

3 小结

综上所述，LBP 可以通过直接清除ROS、提高SOD 等抗氧化酶类活性、调控Bcl-2/Bax 相关凋亡蛋白等发挥抗氧化作用。在Nrf2/HO-1 通路、Cyt-C/Caspase-9/Caspase-3 等通路上有大量的研究，但对其他的靶点和通路仍缺乏更为全面及系统的认识。此外，LBP 还具有抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等多种生物活性，对多种类型的疾病都有一定的治疗作用。但这些研究成果基本都只是停留在动物实验或者细胞实验层面上，所以对于LBP 在眼科疾病及其他疾病的临床应用中仍需要进一步探索。