干细胞外泌体在阿尔茨海默病发病机制中的作用

曾琳琳，付学奇

(吉林大学生命科学学院 Edmond Fischer细胞信号传导实验室，吉林 长春130012)

1 细胞凋亡在阿尔茨海默病(AD)中的作用

AD是一种常见的神经系统退行性疾病，其病理特征为β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积，Tau蛋白高度磷酸化形成的神经纤维缠结(NFTs)，以及大量神经元死亡导致大脑功能调控紊乱，从而出现严重的记忆认知障碍[1]。由于AD的具体发病机制尚不明确，目前临床上并没有成熟有效的治疗手段或者药物。

近年来，阻断神经元大量凋亡已经成为缓解AD的重要方向和手段。Aβ蛋白沉积可引起氧化应激、Ca2+通道受损，进而破坏线粒体，激活线粒体内源性细胞信号传导通路，诱导神经细胞凋亡。Aβ还能够调控凋亡相关基因Bcl-2家族蛋白表达，其中促凋亡基因Bim表达升高，抗凋亡基因Bcl-xl表达降低。

AD分为家族性AD(fAD)或散发性AD(sAD)，fAD主要表现为3种基因的突变：Aβ前体蛋白(APP)、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)，每种基因都编码各自的蛋白质[2]。其中APP可以与死亡受体6(DR6)相互作用，并通过激活DR6，调节肿瘤转移分子机制[3-5]。PS1与PS2均与细胞凋亡密切相关，PS1可以通过γ-分泌酶活性及与Presenilin1相关蛋白PSAP(Presenlin1-associated protein)相互作用两条途径诱导细胞凋亡的发生，而线粒体特异性蛋白PSAP在DR6诱导的细胞凋亡中扮演着重要的角色[6]。由此可见，细胞凋亡在AD发病机制中发挥着重要的作用，阻断神经元大量凋亡是未来预防及治疗AD的重要思路与策略之一。

2 干细胞概述

近年来，干细胞治疗为神经系统退行性疾病的临床治疗带来了希望，干细胞具有自我更新并且在脑组织中分化为神经细胞的能力，可以通过神经营养因子恢复神经可塑性和神经发生[7]。根据分化为不同细胞类型，干细胞可分为4种：神经干细胞(NSCs)、间充质干细胞(MSCs)、胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能干细胞(iPSCs)[8]。这些干细胞都具有不同的特征，可以以不同方式在不同疾病中参与治疗。间充质干细胞因其易于分离及体外培养，而且免疫原性低，不涉及伦理问题，是近年来研究较多的干细胞之一。

MSCs来源广泛，可存在骨髓、脂肪组织、肺、肝和脐带等多种组织[9]，并具有分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和胰岛等潜能[10]。骨髓间充质干细胞(BMMSCs)能够参与免疫系统紊乱和由免疫因子介导的神经退行性疾病，包括IL-1、IL-6、IL-17和肿瘤坏死因子-inhibitor[11-14]。MSCs通过Wnt通路体外介导增加海马区神经再生和分化[15]，而将人脐血间充质干细胞移植到AD小鼠模型的侧脑室或海马区内，可阻断Aβ42的沉积及神经元的变性退化，从而改善记忆认知能力[16-17]。不仅如此，大鼠脂肪源性干细胞(ADSCs)也发现能够诱导分化为神经元细胞，改善AD动物模型认知障碍，提高学习记忆能力[18]。尽管MSCs治疗是一种很有前途的治疗手段，但在应用中都存在着各种各样的缺陷。比如骨髓来源的间充质干细胞，提取和培养困难，限制了其在临床试验中的应用。很多MSCs也存在排斥反应、靶向性和归巢性差等局限性。然而，研究报道MSCs也可分泌多种生物因子，比如神经营养因子、血管生成因子等促进神经再生，保护轴突退化变性，诱导血管生成等，从而在神经系统退行性疾病中发挥作用。

3 外泌体(exosomes)的生物学作用

大量研究指出细胞外囊泡(EVs)在细胞生物学功能与疾病发生中发挥着重要的作用，其中，外泌体是细胞在不同生理条件下释放到细胞外基质的一类直径约40-200 nm的微小囊泡。外泌体在细胞发育、免疫应答、肿瘤发生等生物学过程中研究比较广泛[19-20]。

MSC-EVs能够参与抑制肿瘤的增殖、迁移和侵袭。据报道，MSC-EVs将miR-133b转移至胶质瘤细胞中，通过阻断Wnt/β-catenin信号通路来潜在抑制EZH2的表达，从而抑制胶质瘤细胞的增殖和迁移[21]。hU-MSCs-EVs通过降低Bim、Bad、Bax蛋白水平，抑制caspase-3和caspase-9活化，有效提高大鼠肾小管上皮细胞NRK细胞存活率，从而抑制细胞凋亡，控制顺铂肾毒性，提高顺铂的临床治疗效果[22]。

从角膜基质干细胞(CSSC)中提取的间充质干细胞能预防小鼠角膜损伤后纤维化瘢痕形成，促进透明基质组织再生。来自CSSC的EVs与活细胞同样有效地减少了小鼠角膜伤口的视觉疤痕，说明了细胞外囊泡在CSSC细胞阻断瘢痕形成和启动角膜透明组织再生过程中有重要作用[23]。

MSCs分泌的外泌体对于许多疾病有治疗前景，将周细胞的外泌体移植至脊髓损伤小鼠可恢复其运动功能，因为周细胞的外泌体可以减少病变，改善运动功能，改善血液循环，修复脊髓损伤产生的缺陷。此外，外泌体还可以改善内皮细胞的功能，调节血流，减轻水肿，HIF-1a、Bax、Aquaporin-4和MMP2表达下降而Claudin-5、Bcl-2表达上升，抑制细胞凋亡。同时还与PTEN/AKT通路密切相关，提示周细胞外泌体对脊髓损伤有治疗前景[24]。

4 外泌体在AD中的作用

AD是最常见的神经退行性疾病，可导致学习和记忆障碍。来源于MSCs的细胞外囊泡可以作为一种替代性的治疗手段。MSC-EV不仅具有传递脂类/蛋白质/酶/microRNAs的能力，而且能够抗炎、促进Aβ降解和维持神经活性，因此可以修复突触功能，阻断神经元的死亡，并减缓AD患者的记忆障碍[25]。AD的病理特征源于脑内Aβ的不平衡稳态。研究发现，从AD患者脑脊液和血浆、AD小鼠模型的血浆样品以及表达PS1突变体的神经细胞培养基中分离出的EVs，能破坏神经元的Ca2+稳态，损害线粒体功能，并使神经元对细胞毒性更加敏感。EVs中Aβ含量相对不高，但Aβ42/Aβ40比值有所增加；Aβ大部分位于EVs表面。溶酶体功能受损导致EVs的生成增加，Aβ42表达水平升高。EVs可介导致病性Aβ的跨细胞传播，损害神经元的Ca2+代谢和线粒体功能，从而使神经元易受细胞毒性的影响[26]。

虽然体外实验证明，由AD神经元生成的EVs具有神经毒性，但对AD-EVs在体内的作用机制知之甚少。微管相关蛋白tau的高度磷酸化在fAD相关神经变性中也发挥关键作用，表明Tau蛋白可通过EVs的传递在AD大脑中产生影响。文献报道[27]一名携带PS1A246E突变的fAD患者来源的iPSC-神经元培养基分离出EVs，注射至野生型C57BL/6小鼠的海马区中，5周后，对小鼠实施安乐死并进行病理学评估，与对照组相比，注射fAD-EVs的小鼠在多个部位显示tau蛋白磷酸化增加。此外，fAD-EV注射的海马CA1区tau内含物明显多于对照组。这些研究结果均表明，EVs能够介导fAD相关的tau功能改变，为将来研究EV靶向治疗fAD的临床治疗和药物开发提供了理论依据和科学基础。

Bieberich课题组的实验结果不仅说明外泌体与AD中Aβ的聚集和tau蛋白传播扩散有关，而且，在进一步的实验中，中性鞘磷脂酶-2(nSMase2)在神经细胞中的抑制或沉默可以阻断外泌体的形成。有研究构建了nSMase2基因缺失的AD小鼠，通过体外和体内实验检测Aβ42的生成及聚集，体外实验结果发现抑制了Aβ42对胶质细胞清除的能力，并证明了富含神经酰胺的外泌体能够参与斑块的形成。与普通AD小鼠相比，nSMase2基因缺失的AD小鼠在恐惧条件下的学习任务中降低了脑外泌体生成、神经酰胺水平及血清抗氧化IgG含量，调节胶质细胞激活、Aβ42聚集、tau磷酸化水平，改善了认知能力[28]。

Micci等人研究了海马神经干细胞分泌的外泌体促进突触对Aβ寡聚体(Aβo)弹性的影响，实验从海马神经干细胞(NSC-exo)或成熟海马神经元(MN-exo)培养基中分离的外泌体，在评估Aβο诱导的海马长时程增强(LTP)和记忆缺陷的抑制前，将其注射入侧脑室(ICV)，结果表明，NSC-exo而不是MN-exo，可以消除Aβo诱导的LTP抑制的记忆缺陷，还显著降低Aβo与突触的结合。同时，内源性NSC-exo的转基因切除增加了突触与Aβo结合，而外源性NSC-exo抑制了这种结合。这些结果揭示了一种新的机制，将NSC-exo和突触对Aβo的易感性联系起来[29]。

减少Aβ的积聚是治疗AD的一种主要方法，在AD治疗中，来自不同尺寸支架细胞的外泌体是否能减少Aβ沉积或改善认知功能下降至关重要。文献报道以三维石墨烯支架和二维石墨烯薄膜为基质，进行人脐带间充质干细胞培养，从中提取上清液分离外泌体。3D培养的外泌体(3D-Exo)中195种miRNA和蛋白质(包括neprilysin、胰岛素降解酶和热休克蛋白70)的水平与2D培养的差异显著。因此，3D-Exo可以通过其特殊的载体上调AD病理细胞和转基因小鼠α-分泌酶的表达，下调β-分泌酶，从而降低Aβ的产生，对改善AD小鼠的记忆和认知功能障碍具有增强的治疗作用。这些发现为干细胞来源的支架材料和功能性外泌体提供了新的临床应用[30]。

ADSC在治疗AD等神经退行性疾病方面也具有潜在的治疗前景，许多研究表明，Aβ通过神经元细胞的线粒体功能障碍在AD的进展中起着关键作用。以TG2576 AD小鼠脑NSCs为材料，研究ADSC外泌体(ADSC-Exo)对AD表型的影响。结果显示，ADSC-Exo处理可降低AD细胞的Aβ42、Aβ40水平和Aβ42/40比值。ADSC-Exo处理使p53、Bax、裂解的caspase-3增加，Bcl-2蛋白水平降低，从而抑制AD神经元细胞凋亡。此外，AD患者大脑中被Aβ损伤的轴突生长通过ADSC-Exo治疗得到增强。综上所述，这些发现提示ADSC-Exo在转基因小鼠AD体外模型中具有调节疾病的作用，ADSC-Exo可以作为改善Aβ诱导的神经元死亡和AD进展的治疗源[31]。

5 展望与总结

包括MSCs在内的干细胞对于神经系统退行性疾病的临床应用目前已经得到广泛的认可，但是干细胞治疗依然存在很多问题和风险。近年来，MSCs可通过分泌外泌体参与血管生成、神经元胞体退化，神经轴突变性，神经保护等过程，从而治疗神经退行性疾病。与MSCs相比，外泌体优势明显，结构稳定、体积小，生物相容性较好，可以通过血脑屏障，是治疗神经系统退行性疾病的理想药物载体。但是，外泌体成分复杂，MSCs-EV可分泌多种因子，包括神经营养因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子等，不同细胞来源的外泌体的内容物不尽相同，生物学功能也存在差异。总而言之，外泌体广泛应用于临床治疗，或者作为载体用于药物开发，尤其针对于神经系统疾病，仍然处于起步阶段。还需要对外泌体相关分子机制进行深入的研究，明确不同来源外泌体的内含物、分泌物以及与细胞间的信号传导，不同条件下对外泌体的调控以及其与靶蛋白的相互作用。随着神经退行性疾病的研究不断深入，外泌体在临床应用中的重要作用也会逐渐显现，在临床应用及药物开发中具有广泛前景。