二氢杨梅素通过抑制HMGB1/TLR-4通路拮抗棕榈酸诱导的内皮细胞衰老

刘思妤 刘嫣 欧阳杰

【摘要】目的 探讨二氢杨梅素（DHM）对体外棕榈酸（PA）诱导人脐静脉内皮细胞衰老的抑制作用及其与HMGB1/TLR-4通路的关系。 方法 体外培養人脐静脉内皮细胞株（ HUVECs） ，观察不同浓度二氢杨梅素干预PA处理的HUVECs 衰老的变化。检测细胞衰老、测定细胞上清液HMGB1、IL-6及IL-1β的含量、检测TLR-4 的蛋白表达。 结果 PA处理内皮细胞 48h 能引起细胞β-半乳糖苷酶染色细胞增加，细胞上清液HMGB1、IL-6及IL-1β蛋白含量显著升高，细胞中 HMGB1及TLR-4蛋白表达上调。与PA组比较，可以增加细胞活性; 降低细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率、TLR-4蛋白的表达、细胞中IL-6及IL-1β释放显著减少，呈浓度依赖性。 结论 DHM对体外PA诱导的HUVECs 衰老有抑制作用，其作用机制与减少HMGB1释放、下调TLR-4蛋白表达，从而减少炎症释放有关。

【关键词】二氢杨梅素;HMGB1;TLR-4;HUVECs;棕榈酸

基金项目：湖南省自然科学基金青年项目（2018JJ3480）;湖南省教育厅科学研究优秀青年项目（18B498）;湖南省卫生健康委科研课题（202102040901）;湖南省普通高校青年骨干教师培养经费（湘教通[2018]574号）;湖南省双一流应用特色学科药学学科项目（湘教通[2018]469号）资助。

糖尿病是一种以葡萄糖和游离脂肪酸水平升高为特征的代谢性疾病，其严重的心血管并发症已成为威胁人类健康的主要因素。越来越多的证据表明，血管内皮细胞长期暴露在高脂血症的环境中，会导致内皮提前衰老，并促进血管炎症和动脉粥样硬化，从而导致糖尿病并发症的发生。炎症的过量产生在细胞衰老中起着重要作用。高迁移率族蛋白-1（HMGB1）是一种高度保守的非组蛋白，在高脂环境下HMGB1从细胞核中释放，通过与晚期糖基化产物受体（RAGE）和Toll样受体4（TLR4）结合，进一步触发炎症通路，发挥促炎作用。二氢杨梅素（Dihydromyricetin，DHM）是藤茶中的主要黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、调血脂及降血糖等多种药理活性。有证据表明DHM对心血管有保护作用，但DHM对糖尿病血脂异常状态下引起的血管病变可能的有益作用尚未完全阐明。在本研究中，我们试图证明DHM对棕榈酸（PA）诱导的血管内皮细胞衰老和可能机制的潜在影响。

1 材料与方法

1.1 材料

HUVECs（American Type Culture Collection，ATCC）;DHM、PA（Sigma公司）;DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）和含EDTA胰蛋白酶（HyClone公司）;HMGB1、IL-6、IL-1βELISA试剂盒（博士德生物工程有限公司）;BCA蛋白质浓度测定试剂盒、β-半乳糖苷酶检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）;TLR4和β-actin一抗（博士德生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

HUVECs在含有10 %的FBS及1 %青霉素/链霉素的内皮细胞培养基（DMEM）并于37 ℃，5 % CO2湿润的环境下培养。待单层细胞贴壁达 85% 左右时，可进行传代或后续实验。

1.2.2 实验分组

用DHM （ 0.1、1、10 μmol/L ） 预处理细胞1 h后，再加PA（0.3 mmol/L）干预48h。实验分为：正常对照组、PA处理组、溶剂组、二氢杨梅素（0.1μmol/L） +PA处理组、二氢杨梅素（1μmol/L） +PA处理组、二氢杨梅素（10μmol/L） +PA处理组。

1.2.3 β-半乳糖苷酶染色方法及阳性细胞计数

按厂家说明书对细胞进行 β-半乳糖苷酶染色，于普通光学显微镜下观察人工计数分析统计蓝绿色的-半乳糖苷酶阳性细胞，结果以阳性细胞数/总细胞数100%表示。

1.2.4 酶联免疫法测定IL-6、IL-1β的含量

按厂家说明书，用人HMGB1、IL-6、IL-1β ELISA试剂盒测定不同处理后细胞上清夜中HMGB1、IL-6、IL-1β的水平。

1.2.5 Western blot 法检测蛋白表达

所提细胞总蛋白经SDS-PAGE 分离后以β-actin 为内参照，兔抗羊TLR4 为一抗，通过Western blotting 法测定其TLR4 相对表达量，实验重复3 次。

1.2.6 统计学方法

数据用SPSS 22.0 统计软件进行处理，组间差异显著性采用单因素方差分析（ One-Way ANOVA） 进行统计学分析，组间的两两比较采用LSD法，P< 0.05 认为有统计学差异。

2 结果

2.1 DHM对PA诱导内皮细胞衰老SA-β-gal活性的比较

与正常对照组比较，0. 3 mmol/L PA组SA-β-gal 阳性细胞率明显升高（P < 0.01）。与PA组比较，内皮细胞SA-β-gal 阳性细胞率随着DHM药物浓度的逐渐提高显著降低（P < 0.05 或P < 0.01）（ 图1）。

2.2 DHM 对PA诱导内皮细胞 HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白释放的影响

与正常对照组比较，PA组细胞上清液中HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白含量明显增加 （P < 0.01）。与PA组比较，不同浓度DHM 组内皮细胞细胞上清液中HMGB1、IL-6及IL-1β 蛋白含量呈剂量依赖性降低（P < 0.05 或P < 0.01）（ 图2）。

2.3 DHM 对PA诱导内皮细胞TLR4 蛋白表达水平的影响

与正常对照组比较，PA组TLR4蛋白表达明显增加（P < 0.01）。与PA组比较，不同浓度 DHM组内皮细胞TLR4 蛋白表达呈剂量依赖性降低P < 0.05 或P < 0.01）（ 图3）。

3 讨论

本研究首次证明DHM可通过下调HMGB1及TLR4蛋白表达抑制炎症释放，从而减轻PA诱导的HUVECs衰老。内皮细胞衰老是动脉粥样硬化的起始阶段，研究表明，炎症是诱导衰老的重要因素，而脂毒性刺激可以促进血管内皮细胞衰老。在这项研究中，我们用PA处理HUVECs，模拟糖尿病的血脂代谢病理应激状态，也证实了PA能诱导HUVECs衰老。

血脂异常是动脉粥样硬化的主要危险因素。PA可通过与TLR4辅助蛋白髓样分化蛋白2直接相互作用促进血管损伤的发展。HMGB1是一种必要且充分的炎症介质。当血管损伤时，它可以通过TLR4发出信号，最终导致NF-κB的激活，诱导促炎细胞因子的产生，从而促进炎症。本研究发现PA损伤的血管内皮细胞中HMGB1释放、TLR4的表达水平均高于正常对照组，同时炎性因子IL-6及及IL-1β 释放增加。提示PA诱导的HUVECs衰老与HMGB1释放、TLR4表达升高释放炎性因子有相关性。

以往研究表明，DHM对血管内皮细胞炎症损伤有保护作用[7]。我们的研究证明，DHM能有效降低PA诱导的内皮细胞β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率，抑制细胞衰老。与此同时，DHM能显著降低细胞上清液中炎症因子IL-6及IL-1β的含量，减少HMGB1释放及下调TNF4蛋白的表达。这提示二氢杨梅素改善PA诱导的HUVECs细胞衰老可能与HMGB1/TLR4信号途径有关。

综上所述，HMGB1的表达及释放增加与PA诱导HUVECs衰老有密切关系。二氢杨梅素可以通过减少HMGB1的表达抑制TLR4蛋白表达，从而抑制炎症的发生改善PA诱导的HUVECs的损伤，对降低糖尿病血脂紊乱引起的血管病变发生的风险具有潜在的应用价值。

参考文献

[1] Yamazaki D， Hitomi H，Nishiyama A. Hypertension with diabetes mellitus complications [J]. Hypertens Res， 2018， 41（3）： 147-156.

[2] Wang X， Zhang JQ， Xiu CK， et al. Ginseng-Sanqi-Chuanxiong （GSC） Extracts Ameliorate Diabetes-Induced Endothelial Cell Senescence through Regulating Mitophagy via the AMPK Pathway [J]. Oxid Med Cell Longev， 2020， 2020： 7151946.

[3] Ortiz-Montero P， Londono-Vallejo A，Vernot JP. Senescence-associated IL-6 and IL-8 cytokines induce a self- and cross-reinforced senescence/inflammatory milieu strengthening tumorigenic capabilities in the MCF-7 breast cancer cell line [J]. Cell Commun Signal， 2017， 15（1）： 17.

[4] Yin Y， Feng Y， Zhao H， et al. SIRT1 inhibits releases of HMGB1 and HSP70 from human umbilical vein endothelial cells caused by IL-6 and the serum from a preeclampsia patient and protects the cells from death [J]. Biomed Pharmacother， 2017， 88： 449-458.

[5] Kong X， Feng D， Wang H， et al. Interleukin-22 induces hepatic stellate cell senescence and restricts liver fibrosis in mice [J]. Hepatology， 2012， 56（3）： 1150-1159.

[6] Yin H， Huang L， Ouyang T， et al. Baicalein improves liver inflammation in diabetic db/db mice by regulating HMGB1/TLR4/NF-kappaB signaling pathway [J]. Int Immunopharmacol， 2018， 55： 55-62.

[7] Liu TT， Zeng Y， Tang K， et al. Dihydromyricetin ameliorates atherosclerosis in LDL receptor deficient mice [J]. Atherosclerosis， 2017， 262： 39-50.

第一作者簡介：刘思妤（1981-），女，湖南郴州，硕士，副教授，主要从事中药药理学研究。