四氯化碳诱导急性肝损伤大鼠模型对心脏的影响

张丽丽, 万 鑫, 冀菁荃, 李 婷, 范毅敏, 李宝红, 田帅燕

(1. 山西省长治医学院病理生理学教研室, 长治046000; 2. 山西省长治医学院第一临床学院,长治046000; 3. 山西省长治医学院生理学教研室, 长治046000; 4. 山西省长治医学院机能实验室,长治046000;5. 山西省长治医学院基础医学部,长治046000)

2008年，山西省晋中市发生两起甲苯急性中毒事件，均导致人员死亡。已知甲苯在体内的代谢器官主要为肝脏，其次是脑、肾等。而这两例中毒患者除了有明显的中枢神经中毒症状外，还有心脏及其他代谢器官的损伤，这提示心脏及代谢器官也可能是急性毒作用的主要靶器官［1］。

工业毒物四氯化碳（CCl4）是目前最常用的诱导急性肝损伤的化学物质。CCl4致肝损伤的主要机制是在肝内活化后产生强毒性的二氯甲基自由基（·CCl2）和过氧化甲基自由基（·OOCCl2），引发脂质过氧化，导致肝细胞膜通透性增加，肝细胞大量破坏［2-4］。肝脏是人体最大的代谢器官，当其结构和功能受到损害时必然会引起体内其他重要脏器的结构和功能异常。有文献报道，CCl4腹腔注射会同时损伤动物的心、脾、肺、肾、脑等器官［5］。根据血液动力学特点，来自肝静脉的血液经下腔静脉直接回流至右心房，而心脏是机体内对缺血缺氧等损伤性反应极为敏感的脏器［6-8］。

本研究通过单次腹腔注射CCl4致大鼠急性肝损伤模型的建立，观察急性肝损伤时大鼠心脏功能、结构形态方面的变化；进一步对急性肝损伤后不同时间点、不同浓度CCl4致心脏损伤情况进行比较，从而为急性肝损伤时心肌保护的基础研究及临床防治等后续相关研究工作提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型制备

清洁级雄性SD 大鼠48 只，6 周龄，体质量200～210 g，购买并饲养于斯贝福（北京）生物技术有限公司［SCXK（京）2019-0010；SYXK（京）2019-0030］。大鼠饲养环境为温度20～26 ℃，相对湿度40%～60%，光照周期明暗各12 h，自由饮食，适应性饲养1 周后开始实验。实验方案经本院实验动物福利伦理委员会审核通过（No.DW2018090），符合动物实验3R原则。

大鼠随机分为正常对照组，CCl4低浓度模型组（20% CCl4）、中浓度模型组（40% CCl4）和高浓度模型组（60%CCl4），每组12 只。模型组大鼠一次性腹腔注射新鲜配制的不同浓度CCl4植物油溶液0.3 mL/100 g，正常对照组腹腔注射等体积的植物油。每组大鼠以相同数量，分两批于注射药物后24 h、48 h，用3%戊巴比妥钠按0.1 mL/100 g（体质量）进行腹腔注射麻醉［9］。大鼠取仰卧位固定，连接BL-420F生物信号采集处理系统（购自成都泰盟科技有限公司）的心电图电极，记录标准Ⅱ导联心电图。随后采集血液及肝脏、心脏标本检测相关指标。

1.2 主要试剂

分析纯CCl4（批号20160905）购自天津市富宇精细化工有限公司；丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）（货号C009-1）、考马斯亮蓝蛋白（货号A045-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）（货号A003-1）、总超氧化物歧化酶（total-superoxide dismutase，T-SOD）（货号A001-1）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）（货号A032） 和心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponin I，cTnⅠ）（货号H149-4）检测试剂盒均购自南京建成科技有限公司，植物油为超市购买的橄榄油。

1.3 ELISA法检测大鼠血清酶学指标

经腹主动脉取血，置于冰块上静置1 h，以3 000 r/min 转速于4 ℃条件下离心15 min，取上层血清保存于－20 ℃。按试剂盒说明书检测肝损伤敏感指标ALT水平，用ELISA法检测心肌损伤敏感指标cTnⅠ水平。

1.4 分光光度计检测心肌组织匀浆指标

采用超声波细胞粉碎机制备10%心肌组织匀浆，按试剂盒说明书方法检测心肌组织匀浆中MDA、SOD和CK水平，蛋白定量采用考马斯亮蓝法。

1.5 HE 染色观察肝组织和心肌组织的病理学变化

在大鼠肝左叶相同部位，取大小约1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm 的肝组织；在心尖区，取大小约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的心肌组织。所有组织均置于体积分数为10%的甲醛溶液中固定后，常规脱水浸蜡、石蜡包埋、切片。然后进行苏木精-伊红（HE）染色、中性树胶封固定。光学显微镜下观察各组大鼠肝、心脏组织的病理学变化。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠一般情况

正常对照组大鼠活泼好动，无异常变化。CCl4低/中浓度模型组大鼠存活率为100%，CCl4高浓度模型组存活率为83%。高浓度模型组大鼠一般情况稍差，精神不振，反应迟钝，食量减少。手术操作中观察到正常对照组大鼠肝脏颜色呈鲜红色，表面光滑，边缘锐利；高浓度模型组部分大鼠腹腔有积液，肝脏肿大且表面覆有白色脓状物（图1）。

图1 对照组和CCl4高浓度模型组大鼠肝脏图片Figure 1 Pictures of rat liver in the control and the high concentration CCl4 model groups

2.2 肝脏组织病理学改变

正常对照组大鼠肝小叶结构正常，肝细胞索排列整齐，肝窦结构清晰，未见水肿和坏死肝细胞；CCl4处理后的模型组大鼠肝细胞排列紊乱，肝小叶结构逐渐破坏或消失，细胞质染色不均，肝细胞胞质内出现肿胀空泡和脂滴，而且肝细胞炎性反应及水肿、坏死程度随CCl4注射浓度的增加而逐渐加重。CCl4注射相同浓度不同时间点的大鼠肝脏HE 染色结果无明显差异（图2）。

图2 各组大鼠肝组织病理学变化（HE，×100）Figure 2 Pathological changes in the liver tissue in each group of rats（HE，×100）

2.3 血清ALT和cTnⅠ含量变化

与正常对照组相比，CCl4处理后的各浓度模型组大鼠血清ALT 和cTnⅠ含量均显著升高（P＜0.01）。但低浓度模型组、中浓度模型组48 h 血清ALT 含量较24 h 降低，高浓度模型组48 h 血清ALT 含量较24 h 升高；低浓度模型组、高浓度模型组内两个时间点比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3A）。而高浓度模型组较低浓度模型组24 h 血清cTnⅠ表达水平高（P＜0.05），中浓度模型组、高浓度模型组48 h 血清cTnⅠ表达水平均较24 h 高，差异有统计学意义（P＜0.05）（图3B）。

图3 各组大鼠不同时间点血清ALT含量和cTnⅠ水平Figure 3 Serum alanine aminotransferase（ALT）and cTnⅠlevels at different time points in each group of rats

2.4 大鼠心电图变化

与正常对照组相比，CCl4处理后的各浓度模型组大鼠心电图出现了不同程度的ST段弓背向上抬高、T 波高尖、Q-T 间期延长等电生理变化（图4）。

图4 各组大鼠不同时间点心电图检测Figure 4 Electrocardiogram at different time points in each group of rats

2.5 心肌组织病理学改变

正常对照组大鼠的心肌细胞形态基本正常，均匀整齐排列；低浓度模型组心肌细胞明显肥大，有不同程度水肿，心肌细胞排列不整齐；中浓度模型组心肌细胞炎性反应明显，肌原纤维走向不规则；高浓度模型组心肌细胞脂肪变性更加严重，细胞呈空泡状，无明显心肌结构。心肌细胞炎性反应及水肿、坏死程度随CCl4注射浓度的增加而逐渐加重。CCl4相同浓度组48 h心肌病理改变较24 h更为明显（图5）。

图5 各组大鼠心肌组织病理学变化（HE，×100）Figure 5 Pathological changes in the myocardial tissue in each group of rats（HE，×100）

2.6 心肌组织匀浆MDA、SOD及CK水平变化

与正常对照组相比，CCl4处理后的各浓度模型组大鼠心肌组织匀浆中MDA、CK 含量显著升高（P＜0.05）。中浓度模型组、高浓度模型组较低浓度模型组大鼠MDA 含量升高（P＜0.05），且48 h 时较同浓度模型组24 h 时含量升高（P＜0.05），差异有统计学意义。各浓度模型组48 h CK 含量均较24 h 升高（P＜0.05），48 h 中浓度模型组、高浓度模型组大鼠CK含量较相同时间点低浓度模型组升高（P＜0.05），差异有统计学意义。各浓度模型组SOD 活性均较正常对照组明显降低（P＜0.05），高浓度模型组较低浓度模型组SOD 含量降低（P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠心肌组织匀浆MDA、SOD及CK检测结果Table 1 Content of malondialdehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)and creatine kinase(CK)in each group of rats（-x±s,n=6）

3 讨论

CCl4诱导建立急性肝损伤动物模型是经典的研究方法，该模型最早、最广泛地应用于实验性肝纤维化研究。国内外构建大鼠急性肝损伤模型的文献绝大部分都选择CCl4作为诱导剂。采用CCl4构建肝损伤模型的原因可能有以下几点。（1）CCl4毒性大、造膜周期短。研究发现CCl4进入体内15 min 即可引起肝细胞损伤，至48 h达到高峰。（2）CCl4构建肝损伤模型能准确反映肝细胞功能、代谢及形态学变化，实验指标稳定且重复性好。（3）皮下注射CCl4造模周期长，动物死亡率高，操作不当会发生皮下渗漏；灌胃法造模时间长，且个体差异较大，死亡率高；蒸气吸入法较复杂且容易引起肝外病变。经过比较，多数研究者认为利用CCl4腹腔注射制备肝损伤动物模型具有皮下注射、灌胃、蒸气吸入造模所不可比拟的优点，如快速高效、操作简便、病理结果可靠、不易外漏等［10］。

本研究用不同浓度CCl4油溶液腹腔注射的方法制备急性肝损伤大鼠模型。CCl4代谢产物引起的脂质过氧化反应是致肝损伤的主要机制［11-12］。ALT主要存在于肝细胞质中，当肝细胞受到自由基攻击时，细胞膜通透性增高，细胞内ALT释放量增加，因此血清ALT是反映肝细胞损伤程度的重要指标之一［13-14］。本研究检测大鼠血清ALT含量及HE 染色病理学观察结果均证实，CCl4致急性肝损伤模型制作成功。低/中浓度CCl4模型组均可造成短时的肝毒性刺激，ALT表达在24 h均高于48 h，此变化在一定程度上反映了肝脏的损伤程度和损伤后的修复过程；而高浓度CCl4模型组大鼠随时间延长出现了严重且不可逆的肝损伤病理变化。综上可知，不同浓度CCl4诱导的肝损伤严重程度不同。

心肌细胞极易受毒性物质作用，出现功能和形态结构的改变。cTnⅠ是一种心肌细胞内酶，心肌损伤后cTnⅠ可快速弥散至血浆，对判断心肌损伤的敏感性和特异性较高［15-16］。CK 主要存在于心肌细胞质和线粒体中，心肌损伤后细胞质内CK表达增加［17］。本实验中模型组大鼠的血清cTnⅠ和心肌匀浆CK 含量均明显增加；且模型组大鼠心肌组织病理学观察发现细胞出现了变性、坏死、炎性浸润等不同程度的病理改变，是心肌缺血损伤的直接证据。心电图检测CCl4处理后模型组大鼠出现T波高尖、ST段抬高、Q-T间期延长等电生理变化，也反映了心肌缺血或坏死的程度。

已有研究发现，氧自由基生成及脂质过氧化反应是心肌缺血损伤的重要机制［18］。本研究中，CCl4致肝损伤后可能通过某种机制导致心肌组织发生过氧化损伤，氧自由基与不饱和脂肪酸反应形成过氧化脂质，分解生成MDA。MDA与蛋白质的游离氨基及核酸结合，使生物大分子发生交联，严重损伤心肌细胞膜结构，使心肌细胞肿胀、坏死［19-20］。SOD、MDA 水平变化能够直观反映出氧化应激的变化过程，是测定氧化应激的标志物［21］。本研究中，CCl4处理组大鼠在过氧化损伤作用下，心肌组织MDA 生成增加，清除氧自由基的SOD活性降低。

以上实验中血清cTnⅠ和心肌匀浆CK、MDA及SOD检测结果均证实，高浓度CCl4模型组大鼠心肌损伤程度较低浓度模型组严重，相同浓度CCl4模型组48 h损伤较24 h明显。这说明不同浓度CCl4处理诱导的心脏损伤呈浓度和时间依赖性。

综上所述，通过CCl4急性肝损伤模型的成功建立，观察到急性肝损伤时大鼠心脏功能、结构形态方面的变化，并进一步对急性肝损伤后不同时间点心脏损伤情况进行了比较研究，证实CCl4引起的心肌损伤严重程度取决于毒物的摄入量和持续时间。本研究为临床诊断和治疗毒物所致急性肝损伤心脏病变提供了有力依据，为如何防治和减轻由肝损伤诱发的心肌过氧化损伤提供了新的思路。