小鼠腹主动脉瘤模型的建立及组织学特征分析

夏聪聪, 刘浩乐, 魏盼盼, 成大欣, 胥宝会, 刘恩岐, 赵四海

(1. 西安交通大学医学部实验动物中心, 西安710061; 2. 斯坦福大学血管外科系, 美国加利福尼亚94305)

腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是指腹主动脉局部扩大至动脉横径超过正常值的50%时形成的主动脉致死性疾病［1-2］。晚期动脉瘤破裂是多数AAA患者死亡的主要原因。尽管针对AAA 的研究逐渐增多，但其确切的发病机制目前尚不完全清楚［3］。迄今为止，尚无治疗AAA 的有效药物。AAA 特征性表现为主动脉直径变大、平滑肌细胞减少、弹力纤维层断裂或消失、细胞外基质降解、炎性反应增加等［3-5］。当细胞外基质蛋白质水解，血流负荷力超过局部细胞外基质承受能力时，发生血管破裂。由于目前大多数AAA 患者采用血管内介入方法进行治疗，因此很难收集到临床AAA标本。

啮齿类动物是研究AAA 发病机制的理想模型［5-7］。建立AAA模型的常用方法有：猪胰弹性蛋白酶（porcine pancreatic elastase，PPE）灌注法、血管紧张素（angiotensinⅡ，AngⅡ）法和氯化钙法［7-10］。PPE 灌注法诱导的模型中，小鼠主动脉的一个节段经PPE 灌注5 min 左右，数天到数周的PPE 刺激能引起动脉的弹性纤维断裂、炎性细胞浸润和平滑肌细胞凋亡，该模型很好地模拟了炎性反应在动脉瘤发生发展中的作用［9］。AngⅡ模型的主要特征是动脉夹层出现，造成血管外径增大、中膜破坏，引发炎性反应，以及弹力纤维局部断裂；在研究夹层动脉瘤时，AngⅡ模型较有优势；然而，外源性AngⅡ用量较大，该AAA 模型掩盖了内源性AngⅡ在AAA 发病机制中的作用，其组织学特征不如PPE 模型典型。氯化钙诱导的模型由外膜损伤引起，钙离子转化为CaPO4沉淀，引起弹力纤维层破坏，进而造成外膜损伤；该法不需要复杂的外科手术，可在肾下腹主动脉诱导AAA 的发生。氯化钙模型是一种钙离子局部超载引起的病变，可能与人的疾病起始不完全相同。总之，在研究炎症与动脉瘤的关系上，PPE模型相对稳定，且能直接定位到血管具体位置。

本研究采用PPE 灌注法成功构建小鼠AAA模型，手术操作相对复杂，术中需穿刺动脉，阻断腹主动脉下端的血循环，而且PPE易造成血流重建后的下肢血栓和瘫痪。另外在成模的14 d观察期中，可能需要超声等影像学检测，限制了无影像学设备的实验室应用该模型。针对以上问题，进一步调整手术步骤，降低术后小鼠瘫痪和死亡率，同时建立了一套血管直径测量和组织学评价方法。实验结果显示AAA 模型构建成功，为进一步研究炎症在AAA 发病机制中的作用提供了模型基础和方法学支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

30 只雄性C57BL/6J 小鼠（引种品系C57BL/6JNifdc），8～10周龄，体质量25～27 g，由西安交通大学实验动物中心［SCXK（陕）2018-001］提供，并在本中心饲养和实验［SYXK（陕）2020-005］。30 只小鼠分为两组，20 只小鼠为模型组，腹主动脉阶段性输注PPE溶液；10只小鼠为溶剂对照组，输注PBS。用于组织学比较的正常血管为本实验室留存样本。实验项目经西安交通大学伦理委员会批准实施（批准号：2021-1077），所有实验过程遵循国家实验动物管理的相关法律和规定。

PPE（货号E1250-25 mg）购自美国Sigma公司，用PBS配制成1.5 U/mL溶液备用；过氧化物酶、驴抗羊二抗购自美国Jackson Immuno-Research公司；过氧化物酶底物试剂盒购自美国Vector公司；羊抗小鼠平滑肌细胞α-actin抗体购自美国Novus 公司；大鼠抗小鼠CD68 抗体及羊抗大鼠二抗购自美国BioLegend公司。

1.2 AAA模型的建立

对文献［8］建立的手术方法进行适当优化，具体步骤如下：小鼠称体质量后，放入吸入式麻醉机的诱导麻醉盒，5 %异氟烷吸入诱导麻醉；待小鼠麻醉后，将小鼠仰卧位固定，用吸入面罩吸入2%异氟烷持续麻醉；脱毛膏去除腹部被毛，75%乙醇溶液消毒手术区，沿腹中线切开长2～3 cm 切口，充分暴露肾下腹主动脉至髂动脉段，钝性器械分离动脉周围组织；分离侧支血管后结扎以防止灌注时漏液，游离出1 cm 左右长的腹主动脉段。腹主动脉上下游分别埋8-0 丝线并结扎，在分离出的主动脉下游段用8-0 缝合针头扎破血管，迅速用棉签挤出血液，手持镊子将PE-10 插管沿血管开口处插入血管。结扎固定插管后，用灌注泵迅速推进约30 μL PPE，灌注5 min 后，取下插管，棉签按压去除血管内PPE 残留，10-0丝线缝合血管开口，开放血流，棉签按压止血并关腹。溶剂对照组手术方法同上，但在腹主动脉管腔内灌注的是PBS。

术后将小鼠笼盒置于复温毯保暖数小时，待小鼠活动正常后，将笼盒放回饲养室，整个手术过程在体视显微镜下完成。本研究方法对以往手术步骤主要进行了3点优化：一是利用缝合针刺破血管后，再将插管插入腹主动脉，避免了PE管尖端较软、不易刺破血管或对血管损伤较大的问题；二是为了避免术后血流重建后PPE溶液进入短暂缺血的下肢循环，引起小鼠血栓和下肢瘫痪，在灌注PPE结束后，对PPE进行了清理；三是增加了术后小鼠保温护理，帮助小鼠在代谢较低的情况下快速恢复。

1.3 动脉直径测量及取材

术前及术后14 d，体视显微镜拍照记录小鼠腹主动脉直径变化，直径数据通过软件测量获得（一般用10～20 倍视野图片）。镜下分离腹主动脉，直径增大50%以上判定为AAA 形成。PPE或PBS灌注14 d后处死小鼠，取手术段动脉，包埋于OCT（optim alcutting temperature，一种冷冻切片常用包埋剂）中，行冷冻组织切片分析。

1.4 病变动脉段组织学观察

组织学染色采用标准的生物素-链霉亲和素过氧化物酶法［10］，血管平滑肌细胞及Elastin 染色显示血管壁平滑肌细胞及弹力纤维层降解情况。平滑肌细胞的消耗和弹力纤维层降解从轻度到重度分为4 个级别（Ⅰ～Ⅳ）进行评价AAA。Ⅰ级：弹力纤维层破坏和血管平滑肌细胞减少等损伤仅局限于1层弹力纤维层；Ⅱ级：损伤涉及两层或全部，但仅限于1/4 血管；Ⅲ级：损伤涉及所有弹力纤维层，但仅限于1/2 血管以下；Ⅳ级：损伤涉及所有弹力纤维层并延伸至3/4 血管以上。巨噬细胞染色阳性细胞数量反映血管壁炎性反应程度。

1.5 统计学处理

采用GraphPad Prism 7.0 软件进行统计学分析，数据以±s表示。术前和术后两组14 d 腹主动脉直径数据比较进行方差分析，组内两两比较采用Tukey检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 手术过程及动脉直径扩张

C57BL/6J 小鼠开腹后，首先分离腹主动脉及其分支血管，结扎分支血管游离出腹主动脉，上下游埋线，结扎固定灌注PE-10 套管，灌注PPE或PBS，5 min。手术过程见图1。

图1 腹主动脉瘤的诱导及术后直径变化Figure 1 Induction of abdominal aortic aneurysm and postoperative diameter changes in mice

术前和灌注后14 d 测量小鼠腹主动脉直径，发现PPE灌注14 d后，小鼠腹主动脉血管直径从平均（0.53±0.03）mm 扩张至（1.20±0.12）mm，达到基础血管直径的2.26倍，即血管直径扩张超过50%以上，形成了AAA（图1）。由于灌注的机械张力，PBS溶剂对照组血管直径也显示出一定程度的扩张，平均直径达到（0.78±0.06）mm。

2.2 病变动脉段组织学表现及特征性分析

组织学染色结果（图2）显示，相比于正常动脉血管和PBS灌注后的腹主动脉，PPE灌注小鼠腹主动脉均表现出不同程度的病变，包括血管平滑肌细胞减少、弹力纤维层破坏、外膜巨噬细胞大量累积，炎性反应增加等。病变动脉段组织学结果提示，经PPE灌注腹主动脉后，C57BL/6J小鼠腹主动脉出现典型的AAA 表型。不同阶段的AAA病变特征如图2所示。

图2 术后14 d灌注小鼠腹主动脉病变段组织学表现Figure 2 Histological characteristics of the abdominal aorta in infused mice on day 14 after operation

本实验中，20只小鼠腹主动脉PPE灌注均达到扩张50%以上的标准，都诱导成AAA。20只小鼠模型中，Ⅰ级病变1例（1/20）、Ⅱ级病变2例（2/20）、Ⅲ级病变6例（6/20），Ⅳ级病变11例（11/20）。Ⅳ级AAA病变小鼠可见弹力纤维退行性变和断裂已经非常严重，很难见到正常弹力纤维形态，平滑肌细胞消失殆尽。而且随着病变进展，巨噬细胞浸润增多。由于本模型所用的PPE容易引起急性炎性反应，因此即使在早期或动脉瘤较小时，也可见明显的巨噬细胞浸润。虽然PBS灌注组小鼠也因灌注过程的机械张力，血管呈现一定程度的扩张，但其幅度较小，并未引起比较严重的炎性反应和平滑肌细胞损伤。

3 讨论

PPE灌注法诱导AAA，需要穿刺血管、阻断血流，整个手术操作过程相对复杂，用时长。有研究者提出了一种基于血管外膜弹性蛋白酶浸泡PPE法可以诱导建立AAA，尽管此模型在技术简便性方面显示出优势，但造模后期存在自我修复现象，说明该造模方法并不稳定，而且动脉直径扩张较小，需要很高浓度的PPE才能促进血管扩张［11］。本研究采用的PPE 灌注法手术过程虽然比较复杂，但造模成功率高，稳定性好，且具有良好的定向性，能够定位到具体血管部位。PPE模型的优点是可以精确定位（例如可以将病变定位到肾下腹主动脉段）、模拟人类AAA的主要病理学特征，且病变比较典型。PPE灌注诱导AAA在不同实验室使用的PPE浓度稍有区别，手术成功率也稍有差异。影响PPE模型广泛推广和应用的瓶颈在于手术过程较难，术者需要较高的外科学基础和较长时间的训练。通常手术过程中PPE灌注需要中断下肢血循环，在再次开放血流时，灌注段的PPE会随血流进入下肢，这加剧了缺血再灌注损伤，容易引起血栓，严重时会导致小鼠下肢瘫痪，造成手术失败，这也是影响PPE模型广泛应用的一个关键因素。在本研究中，通过对现有造模方法进行优化，缩短了手术时间，减少了PPE引起的血栓形成和术后动物死亡风险。另外，缺少影像设备辅助，也是限制PPE模型推广的一个因素。本实验通过手术显微镜下摄影计算，基本解决了这一问题；虽然不能动态观察活体动物术后血管直径变化，但不影响实验结果的判断。

本实验通过分离肾下腹主动脉至髂总动脉段，阻断血流，并向腹主动脉腔内灌注1.5 U/mL弹性蛋白酶溶液5 min，术后14 d 取材，发现PPE处理后小鼠血管直径扩张可超过50%，达到AAA 诊断标准。病变动脉段组织学分析发现，动脉壁的弹力纤维层断裂，平滑肌细胞凋亡，以及炎性细胞浸润增多等典型的AAA 特征。本实验分析了20 例小鼠模型的AAA 病变组织，用PPE建模后，大多数可达到AAA病变Ⅲ到Ⅳ级。小鼠腹主动脉PPE灌注节段，弹力纤维破坏较重且典型，血管中外膜巨噬细胞浸润明显，平滑肌细胞标志逐渐变弱消失，平滑肌细胞逐渐消失殆尽。而在溶剂对照组，机械张力虽然可以诱导一定程度的血管扩张，但其血管直径变化较小，组织学改变不明显。PPE 灌注模型最初在Wistar 大鼠体内建立，PPE 灌注后通常分为2 个阶段：第一阶段即PPE灌注后0～7 d，特征性表现为中度主动脉扩张和急性炎症，涉及的细胞有内皮细胞、血管平滑肌细胞、成纤维细胞和中性粒细胞；第二阶段即PPE 灌注后8～14 d，在第14 天左右形成动脉瘤，可以观察到弹力纤维层断裂、炎性细胞入侵增加，以及T细胞和单核细胞的募集增加、局部基质金属蛋白酶活性增加［12］。PPE模型的血管膨胀是机械性和药物作用的叠加，通常PPE灌注小鼠腹主动脉2周后，血管直径扩张至初始的50%以上后，逐渐进入平台期［13］。PPE灌注后不久，由于大量的弹性蛋白和弹力纤维降解，一般2周后血管壁呈纤维化状态，动脉瘤直径大小逐渐趋于稳定［14］。外源PPE 灌注本身并不诱发AAA，但弹性蛋白酶灌注会触发内源性机制，如通过白细胞清除降解的细胞外基质、平滑肌细胞消耗以及内皮损伤等。近年来，PPE诱导的AAA模型已越来越多地被用于AAA干预的药理学研究。

综上，本实验室建立了一种行之有效的小鼠AAA 建模方法，同时提出和总结了对AAA 组织学评价的方法体系，这将有助于研究AAA 的发生、发展及其干预对策。