2013—2020年7次实验动物病原菌项目国际比对结果分析

邢 进, 冯育芳,王 洪,张雪青,高 强,岳秉飞,付 瑞

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,北京102629)

国际实验动物科学理事会（International Council for Laboratory Animal Science，ICLAS）在2007 年建立了诊断实验室性能评估程序（Performance Evaluation Program for Diagnostic Laboratories，PEP）（简称“国际比对”）。通过ICLAS提供的PEP标准样品，各参加实验室能够评估自身的检测水平和能力［1］。参加PEP活动有助于检测实验室使用科学可靠的程序来监督检测质量，同时可获得国际同行专家的帮助和建议，促进实验室实施质量保证措施，有助于提高动物质量检测技术、水平和能力，确保实验动物的质量［2］。样品由经国际认可的实验室制备和确认后，发送给世界各地想要参加PEP活动的实验室进行比对检测。样品均为盲样，当前的PEP样品库包括可以感染大鼠和小鼠的常见病原体，涉及病毒、病原菌和寄生虫。每次PEP活动需要检测10 个或20 个样品，可能是病毒、细菌、真菌、寄生虫等病原样品和微生物抗体血清样品的不同组合。PEP对检测方法没有限制，参加实验室依据自身检测体系和能力开展检测，所得结果与ICLAS反馈的预期结果相比较，对检测方法的特异性和敏感性进行监测和评估［3］。2020年的PEP活动共有21个实验室参与，其中亚洲6个、大洋洲2个、欧洲9个和北美洲4个［4］。

2013—2020 年，本实验室共参与了7 次ICLAS 的PEP 活动（2015 年未参加），是参加次数最多的国内实验室。病原菌项目在PEP中占有很大比例，本文针对病原菌部分进行总结，对国内实验动物的病原菌检测项目和方法起到查漏补缺的作用，以促进我国实验动物质量控制的发展。

1 材料与方法

1.1 培养基和试剂

哥伦比亚血琼脂培养基为英国Oxiod 公司产品；无菌脱纤维羊血为北京陆桥技术股份有限公司产品；DHL琼脂培养基、高盐甘露醇琼脂培养基为北京三药科技开发公司产品；革兰染色液为法国生物梅里埃公司产品，细菌鉴定板为美国BD公司和法国生物梅里埃公司产品；DNA提取试剂盒为德国Qiagen公司产品；PCR试剂为日本TaKaRa 公司产品；荧光定量反应预混液为美国Applied Biosystems 公司产品；普通PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；荧光定量PCR引物和探针由美国Invitrogen公司合成；羊抗小鼠、大鼠辣根过氧化物酶为美国KPL公司产品；支原体的酶联免疫吸附测定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂和泰泽病原体的间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）检测试剂均由本实验室自制；泰泽病原体ELISA和CAR杆菌、肺孢子菌ELISA检测试剂盒购自苏州西山生物技术有限公司。

1.2 仪器设备

生物安全柜购自美国Nuaire公司（型号NU-437-400S）；恒温培养箱购自美国Thermo 公司（型号IGS180）；细菌鉴定仪购自美国BD 公司（型号Phoenix100）和法国梅里埃公司（型号Vitek2 Compact）；酶标仪购自美国Thermo 公司（型号MK3）；冷冻离心机购自德国Hettich 公司（型号22R）；PCR 仪购自美国ABI 公司（型号Verit96）；荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司（型号7500Fast）；电泳仪购自美国Bio-rad 公司（型号Powerpac HC）；紫外凝胶成像系统购自美国Kodak公司（型号GL212pro）。

1.3 PEP样品

7次PEP样品共90份，包含病毒、细菌、真菌、寄生虫和微生物抗体5 个种类，见表1。样品经冷链干冰运输，到达本实验室后，保持内包装完整，置于－80 ℃冻存。经海关监管检查后方开展实验。PEP 样品的最小包装为螺口1.5～2.0 mL 冻存管。根据ICLAS 提供的样品清单，含细菌样品32 份、真菌样品1 份、寄生虫样品2份、病毒样品15 份和40 份微生物抗体样品。在抗体样品中也包含病原菌检测项目。细菌培养或抗体检测样品体积均0.5 mL，真菌DNA 样品体积0.1 mL。

表1 7次PEP样品的病原种类Table 1 Pathogeny types of seven batches of PEP samples

1.4 样品培养

依据国家标准［5］，先对细菌样品进行培养和生化鉴定。用接种环蘸取样品液接种于5%血琼脂培养基、DHL 琼脂和高盐甘露醇琼脂培养基，36 ℃需氧培养24～48 h，记录菌落形态。挑取典型单个菌落，相同条件次代培养后，用自动细菌鉴定仪鉴定。

1.5 抗体检测

依据国家标准［6-7］或试剂盒说明检测微生物抗体样品。将5倍PBS稀释的待检样品用PBS再稀释10 倍或2 倍，至体积比为1∶50 或1∶10，然后分别用于ELISA和IFA检测。

1.6 核酸检测

通过前期的样品培养，对已分离到病原菌的样品，提取目标菌基因组DNA，扩增16S rDNA，将序列比对结果与生化鉴定结果相互验证。当采用培养法未见病原菌生长时，吸取20 μL样品原液，提取DNA，扩增其16S rDNA。同时采用特异引物（表2）扩增可疑病原。对细菌DNA样品则直接扩增16S rDNA，对真菌DNA的样品扩增ITS 序列。目的片段送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，所得序列在Genbank （https：//blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast.cgi）中进行序列比对。

表2 7次PEP项目中所用PCR引物和探针Table 2 Primers and probe used in seven PEP projects

2 结果

2.1 预期结果

向ICLAS提交检测结果后，即获得当次PEP样品的预期结果，见表3。

表3 7次PEP病原菌项目汇总Table 3 Summaries of pathogenic bacteria in seven PEP projects

7次PEP病原菌项目共40份样品，涉及27种病原菌；其中，病原检测33 项（含活菌样品29份、核酸样品4 份），抗体检测7 项（抗体样品7份）。与预期结果相比较，本实验室7 次PEP 检测结果的符合率分别为8/8、2/2、5/8、9/9、5/5、6/7和1/1，见表4。

表4 检测方法和结果符合率Table 4 Test methods and coincidence rates of results in seven PEP projects

续表

2.2 不符合项目

全部40份病原菌样品中，有以下4个项目的检测结果出现偏差：（1）2016 年的41-7 CAR 杆菌血清样品检出腺病毒（Adenovirus）抗体阳性，未检出目标抗体CAR 杆菌抗体；（2）41-8大鼠血清中检出淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）抗体阳性，未检出泰泽病原体抗体；（3）将41-15乳腺炎棒状杆菌（Corynebacterium mastitidis）误鉴定为眼棒状杆菌（Corynebacterium oculi）；（4）在52-5 小鼠粪便中检出泰泽病原体核酸阳性，漏检啮齿类螺杆菌。

3 讨论

PEP 网站公布的现行样品库为2012 版［15］，包括小鼠和大鼠两种动物的样品。其中，小鼠样品35项，病原菌和病毒分别为21项和14项；大鼠19 项，病原菌11 项，病毒7 项，寄生虫1 项。本实验室参与的7次PEP活动中，共40份病原菌样品，涉及27 种病原，样品全部为液体，分为病原检测和抗体检测两种类型。样品形式涵盖菌液、水、气管冲洗物、血清、核酸等，采用病原菌培养、抗体检测和核酸检测3种方法。在27种病原菌中，绿脓杆菌、肺炎链球菌、辛氏鲍特菌、假结核耶尔森菌、乳腺炎棒状杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌和念珠状链杆菌这8种细菌超出了PEP样品库的范围，说明样品库仅为基础项目，实际检测项目仍在不断更新。相比而言，我国实验动物质量检测标准涉及的病原菌种类尚有欠缺，一些检测项目在我国缺少相应标准，比如PEP样品中出现的辛氏鲍特菌、黏质沙雷菌、乳腺炎棒状杆菌、CAR杆菌、小鼠放线杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌、产酸克雷伯杆菌、无乳链球菌和致病性大肠埃希菌这9个项目，以及尚未出现的嗜麦芽假单胞菌（Stenotrophomonas maltophila）、兽 疫 链 球 菌（Streptococcus zooepidemicus）和弯曲菌属（Campylobacterspp.）等（后两项为Charles river检测项目）。在检测工作中，以上病原菌偶有检出，应引起重视，并尽快制定相应的检测标准。

我国实验动物质量检测标准中的检测技术和方法亟待补充和更新。PEP的微生物样品均为盲样，对检测方法不做要求。采用分离培养方法时，需要考虑到培养的温度、气体环境、时间等条件，检测过程复杂。根据ICLAS网站公布的检测项目，血琼脂平板可以满足绝大部分采用培养法检测病原菌的生长需要。根据在血琼脂平皿上的生长特性，并参考在DHL 和高盐甘露醇等选择性培养基上的生长状态，可直接缩小检测范围。对于单一病原的样品，检测过程相对简单，同时采用16S rDNA 测序的方式则更为简便。如根据样品信息缩小检测范围，采用特异的PCR方法会事半功倍。34-9、44-13 和52-5 样品在血琼脂中未见菌落生长，直接对样品提取DNA，通过特异性PCR 检测，以及16S rDNA 测序验证，得到啮齿类螺杆菌和肺支原体的结果。因培养法较为费时，对44-13 肺支原体样品直接按核酸样品检测。肺孢子菌（Pneumocystisspp.）是一类条件致病真菌，国际上将其列为真菌检测项目。现行的国家标准GB/T 18448.4—2001规定了卡氏肺孢菌（Pneumocystis carinii）的染色镜检方法仍作为寄生虫检测项目，对检测人员水平和样品要求较高［16］。44-19 小鼠肺孢子菌为真菌DNA样品，本研究中使用真菌通用引物ITS1/ITS4 扩增和测序获得了结果。此外，病原菌名称也在不断更新变化。大肠埃希菌O115a，c：K（B）更新为啮齿类枸橼酸杆菌［17］，CAR 杆菌的拉丁名称更新为Filobacterium rodentium［18］，嗜肺巴斯德杆菌Heyl 生物型更新为Rodentibacter heylii［19］。建议尽快修订相关标准，与国际标准名称一致。2017年中国实验动物学会颁布了首批团体标准，其中涉及牛棒状杆菌的实时荧光PCR检测方法，以及螺杆菌的普通PCR 和实时荧光PCR检测方法；针对其他不易培养的病原菌，如泰泽病原体、CAR杆菌、支原体等，也应尽快制定相应的分子生物学检测标准，助力实验动物质量检测。

检测试剂与菌种资源的缺乏亟需解决。血清样品可能存在多种病原抗体的情况，如41-7 和41-8样品同时检出腺病毒和LCMV抗体，44-6样品（鼠腺病毒2 型血清样品，表3 中未列出）检出泰泽病原体抗体；这可能与制备时的动物血清本底有关，更要求检测试剂具有良好的特异性和敏感性。CAR 杆菌、兔脑原虫等ELISA 检测试剂盒仍然需要进口，国内缺少自主知识产权的检测试剂，限制了检测工作的开展。例如，41-15样品的生化鉴定结果是眼棒状杆菌，16S rDNA序列与乳腺炎棒状杆菌（Genbank AY834747.1）和眼棒状杆菌（Genbank KJ938710.1）符合度分别为99.09%和97.00%，结合眼部病灶分离菌的备注提示，判定为眼棒状杆菌（系错误结果）。可见在实际检测中遇到新发病原菌时，设置阳性菌株对照很重要，而且应对生化结果进行验证，须结合测序结果和文献报道来慎重判定。再如，52-5 的小鼠粪便样品检测结果是啮齿类螺杆菌，核酸检测结果却是泰泽病原体，对粪便革兰染色也同样提示梭菌，最终导致螺杆菌漏检。因此，如能建立同时检测多种病原的高通量抗原和抗体芯片检测方法，将会极大地促进实验动物微生物检测水平的提升。

经过连续参加PEP活动，充分评估和验证了本实验室的检测能力。目前我国实验动物质量检测水平仍不均衡，在检测新技术应用、病原检测种类方面与国际水平尚存在差距。我国实验动物质量检测项目的设置有较大局限性，国家标准中的检测方法相对落后，病原名称、检测方法和技术有待更新，检测试剂亟需开发。同时，本实验室作为能力验证提供者，在PEP活动中也获得了丰富的经验，这将有助于国内能力验证活动的改进，以促进国内实验室检测能力进一步提高。