DNA甲基化在阿尔茨海默病发病机制中作用的研究新进展

栗鋆 邵宏元 刘凡

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种与年龄相关的慢性进行性不可逆性的认知功能衰退的神经退行性病变，主要以认知功能障碍、精神行为异常、日常生活活动执行困难三组主要症状为特征[1]。AD的病因至今尚不明确，细胞外淀粉样蛋白β(Aβ)聚集、细胞内过度磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结(NFT)和进行性神经细胞死亡是AD的主要病理学特征[2]。DNA甲基化是影响基因活性的主要表观因素，其异常与很多疾病相关，包括癌症、代谢性疾病、心血管疾病、神经退行性疾病等[3]。DNA甲基化是表观遗传学机制重要组成部分，可调控多种基因表达。DNA甲基化在脑发育和神经发生的表观遗传调控中发挥重要作用，并且其变化是衰老过程的一个重要因素，在与年龄相关的神经系统疾病的发病机制中起至关重要的作用。在衰老的大脑中，DNA甲基化的丢失可能会减少成年人的神经发生，并导致与年龄相关的学习和记忆能力下降[4]。因此，人们有充分理由相信DNA甲基化和AD之间存在很强的潜在联系。现就DNA甲基化在AD疾病机制及治疗方面发挥的作用研究进展进行综述。

1 DNA甲基化异常与AD发病的关系

DNA甲基化在AD发病中发挥重要作用。De Jager等[5]采用队列研究708个前额叶皮质样的DNA甲基化差异，发现有71个甲基化水平与AD的神经病理改变明显相关，包括与AD易感性变异有关的ABCA7和BIN1的CpGs。研究发现，可预测实际年龄的DNA甲基化位点在AD大脑中显示出加速衰老的变化，尽管这些位点尚未与特定的效应基因相联系[6]。这些在AD患者中表现出特异性的DNA甲基化位点，可能通过不同途径参与疾病的发生发展。

1.1 DNA甲基化与Tau蛋白tau是一种可溶性蛋白，主要存在于神经轴突中，可稳定微管，确保正常的轴浆运输和突触可塑性。在疾病发病中，tau蛋白会过度磷酸化并形成不溶性聚集物[7]。tau负荷与神经元死亡和认知能力下降相关，加速疾病的进展。tau翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等，其中tau的磷酸化是主要的翻译后修饰事件[8-9]。tau磷酸化既能对神经元造成损伤，又具有保护作用[10]。而tau磷酸化异常会导致微管塌陷、轴突变性和轴浆运输障碍，从而影响神经递质的合成、运输、释放和摄取，最后导致神经变性[11]。

糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是一种主要磷酸化tau的蛋白激酶，在小鼠胚胎干细胞中，GSK-3β的缺失会导致DNA甲基转移酶(DNMT)3a2表达减少。蛋白磷酸酶2(PP2A)是脑部一种主要的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，其对tau的底物特异性受PP2A甲基转移酶的调节，AD患者中PP2A甲基化的减少与甲基化酶LCMT-1的减少和去甲基化酶PME-1增加有关，最后PP2A失调导致过磷酸化tau蛋白的累积和神经退行性变[12]。在痴呆大鼠模型的海马CA1区，周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)的启动子区存在低水平的胞嘧啶甲基化，从而使CDK5表达上调，导致tau过度磷酸化，抑制长时程突触增强，造成空间学习和记忆障碍[13]。CDK5抑制剂罗斯科维汀可显著降低tau蛋白的磷酸化，提示细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂在AD中具有应用前景。此外，在AD患者和转基因tau小鼠中，PTK2B与过度磷酸化的tau在进展性病理阶段中共存，表明PTK2B是AD的一个遗传危险因子，可能参与了tau的病理生理过程[14]。脑神经营养因子(BDNF)可能与tau过度磷酸化密切相关，Tet1调控BDNF的DNA去甲基化可能影响tau磷酸化水平。上述研究表明，靶向调节tau磷酸化相关基因的甲基化水平可能是治疗AD的一种潜在策略。

1.2 DNA甲基化与AβAβ的过度产生和积累形成斑块会导致神经退行性病变，致病性Aβ的产生需要β分泌酶(BACE1)，它能裂解淀粉样前体蛋白(APP)，这是Aβ产生的限速步骤。AD的突触功能障碍早在神经元大量丢失之前即已出现，其原因是BACE1水平升高促使突触终末产生过量的毒性Aβ[15]。Aβ的病理性过度累积会导致氧化损伤、炎症、血-脑屏障损伤、NFT形成和记忆受损[16]。有研究表明，Aβ斑块可促进tau聚集，进而形成细胞内NFT[17]。

AD神经元中位于DSCAML1内含子3的增强子存在广泛的DNA甲基化缺失，而染色质构象分析表明，DSCAML1中的增强子对应BACE1基因启动子，这些增强子的低甲基化发生于AD的早期，与疾病早期BACE1表达量的异常增高相对应[18]。因此可推测，DSCAML1中增强子的低甲基化激活靶基因BACE1启动子，诱导AD患者Aβ斑块和NFT病理的形成和进展。Aβ反过来参与影响神经发生和细胞周期基因的增强子的低甲基化，细胞周期基因的重新激活促进了tau的过度磷酸化，并与Aβ斑块一起导致AD病理的形成和扩散，最终导致神经元死亡和AD认知障碍[19]。脑啡肽酶是两种羟基降解酶之一，在正常衰老大脑及AD大脑中存在脑啡肽酶表达下调。Li等[18]研究表明，脑啡肽酶启动子区域的高甲基化会抑制脑啡肽酶表达，进而降低Aβ清除率，增加Aβ的聚集。但也有研究表明脑啡肽酶启动子的DNA甲基化与AD的发展和进展无关[20]。

Aβ可通过高甲基化BDNF外显子4的启动子抑制BDNF的表达，而S-腺基甲硫氨酸作为主要的甲基供体，可通过减少BDNF外显子4的启动子的甲基化水平逆转Aβ对BDNF表达的抑制作用[16]。Liu等[21]研究结果显示，Aβ可降低DNMT的活性，增加PSEN1和APP的表达，降低细胞活力，而叶酸可剂量依赖性地刺激甲基化电位和DNMT活性，增加PSEN1和APP启动子的甲基化，降低PSEN1和APP表达，保留部分细胞活力。Lardenoije等[22]给予APPswe/PS1dE9小鼠接种Aβ疫苗发现，主动免疫并不影响整体DNA甲基化水平，但可导致DNA羟甲基化和DNMT3a水平下降，但Aβ累及与DNA甲基化水平无关，而与DNA羟甲基化和DNMT3a水平呈正相关。有研究者以AD模型大鼠为实验对象，筛选灵芝提取物中含有主要抗衰老活性的提取物，以评价其对DNA甲基化的影响，结果显示，灵芝提取物不仅能改善学习记忆功能，延缓神经元凋亡和脑萎缩，还能使组蛋白H3、DNMT3a、DNMT3b等甲基化调控因子上调，并下调AD细胞内标记物Aβ1-42的表达[23]。

1.3 DNA甲基化与载脂蛋白E载脂蛋白E基因(APOE)的ε4等位基因是一个公认的迟发性AD(LOAD)的遗传风险因素。人类APOE基因有3种遗传变异，分别是ε2、ε3和ε4，可分别翻译3种蛋白质亚型APOE2、E3和E4。研究显示，与无上述任何一种等位基因者比较，携带一个ε4等位基因的人患AD的风险增加2～3倍，而携带两个ε4等位基因的人患AD的风险增加约12倍，ε2对AD有一定保护作用[24]。

Karlsson等[25]通过使用Illumina 450K芯片检测447对瑞典双胞胎(平均年龄78.1岁)白细胞DNA甲基化水平发现，APOE基因启动子区域的甲基化与痴呆和AD相关，其甲基化程度越高，AD发病风险越大。因此，APOE启动子中的DNA甲基化具有阐明疾病机制和识别临床前疾病的生物标记的潜力。但也有研究表明，AD的认知减退症状和家族史与APOE甲基化无关，其中伴随AD相关认知能力下降出现的APOE的表观遗传变化可能是由疾病的病理生理或AD导致的机体适应性反应引起[24]。所以，AD发病与APOE及其甲基化的确切关系需要进一步研究。

非神经细胞主要参与AD中APOE的DNA甲基化降低，非神经细胞主要为胶质细胞，其中星形胶质细胞是脑内APOE的主要产生者。Tulloch等[26]研究显示，与对照组比较，AD额叶组织中的DNA甲基化水平较低，神经元APOE基因的DNA甲基化水平明显高于胶质细胞，这种甲基化减少是胶质细胞特异性的，提示胶质细胞表观遗传调控的APOE表达的改变可能是其对AD患病风险产生影响的重要原因。

与AD相关的第三大相关负荷风险基因是聚集素基因(CLU)，也被称为载脂蛋白J，但其效应远小于其他APOE基因。有研究者使用Sanger测序检测了与AD疾病密切相关的6个基因CpG岛(CGI)的甲基化差异，发现其中CR1、CLU和PICALM的甲基化水平在AD者中明显降低[27]，提示深入研究CLU甲基化对AD病理的影响并探究其在诊断治疗方面的潜力具有重要意义。

2 DNA甲基化与AD治疗

DNA甲基化在记忆和学习中起重要作用，AD患者脑组织内呈现整体低甲基化，与甲基供体一起进食有助于预防和治疗AD。低叶酸和高同型半胱氨酸浓度与认知能力差密切相关，补充叶酸似乎可改善轻度认知功能障碍患者的认知功能，并降低血液中与低氧核糖核酸相关的生物标记物水平[28]。缺乏维生素B会导致AD鼠脑内GSK-3β启动子区域的甲基化减少，从而使GSK-3β表达增加，最终导致tau蛋白的过度磷酸化。最新一项Meta分析显示，补充维生素B能有效降低血清同型半胱氨酸水平，然而其并不能提高AD患者的认知能力，这与既往研究结果矛盾，关于补充维生素B是否能改善AD患者认知能力仍需进一步探索。

有研究者提出了同源性辅助修复依赖表观遗传工程(HARDEN)手段，这是一种利用内源性DNA双链断裂修复途径靶向DNA甲基化的新方法，这种方法允许通过体外甲基化外源性修复模板，通过同源定向修复实现稳定的靶向DNA甲基化，并证明HARDEN可应用于神经退行性疾病基因C9orf72和APP，有望在AD的治疗中发挥新的作用[29]。

动物和细胞研究表明，铅可以特异性地降低DNMT1和DNMT3a的表达，从而导致APP和BACE1等AD相关基因的低甲基化，导致Aβ异常聚集[30]。细胞学研究显示，短期接触镉与DNA低甲基化有关，而长期接触与DNA高甲基化有关[31]。砷甲基转移酶以S-腺基甲硫氨酸作为甲基供体，将无机砷甲基化，降低其毒性，因此砷可以通过耗尽细胞的甲基供体而导致DNA低甲基化[31]。因此，营养治疗可能成为防治AD的有效选择，特别是与乙酰胆碱酯酶抑制剂、脑锻炼、体育锻炼等其他抗痴呆干预措施相结合，从而有望找到一条预防和治疗AD的途径。

3 展望

AD病因尚不清楚，诊断和治疗手段缺乏，尽管目前已经明确表观遗传学在其发病过程中发挥了重要作用，但仍需更多研究以明确表观遗传机制，尤其是DNA甲基化在疾病发病机制中的作用。

DNA甲基化在tau蛋白的异常磷酸化和可变剪切、β蛋白的异常聚集、APOE的表达等方面发挥作用，相关位点的甲基化改变有可能成为AD未来一个新的生物标志物，并且可以为针对神经退行性疾病表观基因组的临床前用药提供科学依据。生物信息学算法可以用来进一步探索当前的DNA甲基化数据，尤其是转录组与甲基化联合分析，可以获得与AD相关的其他可靠信息。

此外，学者们还探究了甲基供体及其他疾病相关危险因素的预防在疾病中可能发挥的作用，某些中药(如灵芝)可能通过调控相关甲基化因子对AD发挥治疗作用。总之，揭开DNA甲基化在AD中的确切作用仍然是一项具有挑战性的任务，特别是其在疾病诊断治疗中发挥的作用，仍需进一步探索。