生物检材中氯氮平分析方法研究进展

徐 翩，张 松

（重庆市公安局a.物证鉴定中心；b.交通管理局,重庆401147）

1 引言

氯氮平（clozapine）系瑞士山德士公司（诺华公司的前身）于1961年研制成功的抗精神分裂症药物，属于二苯并二氮卓衍生物类化合物。临床试验表明，氯氮平具有很强的抗精神病作用。此外，它还有缓解疼痛、抑制肾上腺素与去甲肾上腺素导致的升压等作用，且锥体外系副反应极少，可用于治疗急慢性精神分裂症、癫痫或智能发育不全所产生的兴奋躁动状态。然而一部分使用氯氮平治疗的精神病人会患有一种名为“粒细胞减少症”的白血病，严重者可在服药3月后死亡。尽管如此，氯氮平仍然因其低廉的价格及良好的疗效占据我国精神病治疗药的部分市场[1-4]。氯氮平的使用者多为精神病患者，其自控能力较差，意外过量服用导致中毒死亡的事件时有发生[5,6]。此外，在麻醉抢劫、强奸案件中涉及氯氮平的案例也越来越多[7]；更有甚者，罪犯利用氯氮平投毒的案例亦有报道[8,9]。因此在过去的几十年中，研究者开发了各种分析方法检测氯氮平，包括液相色谱与质谱联用法(HPLC-MS)，气相色谱与质谱联用法(GC-MS)和电化学分析检测方法等。本文以生物样品为检材，综述了近年来氯氮平检测技术的研究进展。

2 色谱分析法

2.1 薄层色谱法（TCL）

薄层色谱法是根据分子的极性大小，选择合适的溶剂作为流动相达到分离、定量目标物的一种层析分离技术。TCL法是毒物分析实验室使用最为简便、有效的定性定量分析方法。王清海[10]等在1989年提出了氯氮平在血液中的薄层色谱扫描检测方法，其中氯氮平扫描线性范围为0～0.14μg/3μL，最低检出限为0.1μg/mL。在碱性溶液中(PH=9～12)用乙醚萃取，药物的回收率达80%以上。TCL方法操作简便快速，无需复杂的仪器，也不需要专业的操作人员，因而可以用于氯氮平的现场测定。但由于薄层色谱法常出现假阳性，主要用于高浓度检材中氯氮平成分的分析。

2.2 气相色谱法（GC）

气相色谱法具有高分离性，在医药卫生、环境监测和食品检验等行业都有广泛的应用，是氯氮平检测中常见的方法之一。苏晓红[11]等在2009年建立了GC与氮磷检测器(Nitrogen Phosphorus Detector,NPD)联用的方式同时测定胃内容中氯氮平和氯普噻吨的方法，使用该方法对胃内容样品中氯氮平的定性分析得到了较为满意的结果，氯氮平的出峰时间为22.987min。王哲焱[12]等在2011年同样采用GC－NPD联用，以SKF－525a为内标来检测生物检材中氯氮平的含量。该方法氯氮平的保留时间为7.8 min，且与生物检材中的杂质峰分离良好，在0.1～48μg/mL内有较好的线性关系，最低检出限为0.1μg/mL，提取回收率及精密度均达到检案要求，同时重现性好、灵敏度高，可满足定性、定量检验的分析要求。

2.3 气相色谱－质谱联用法（GC－MS）

与GC相比，GC－MS将GC的高分离能力和MS的高鉴别能力结合起来，用该方法对氯氮平进行检测也是目前研究者们普遍认可的。国外较早用GC－MS法测定氯氮平的报道是Bondesson[13]在1988年所发表的，由于CLP分子结构含有胺基，与酰卤发生酰基化反应具有反应速度快、反应完全、定量准确的优点，且衍生化物中含卤素能够达到更低数量级的检测限，于是Bondesson采用五氟丙酐(PFPA)作衍生试剂，以Propylnorclozapine为内标测定氯氮平含量。国内则是朱荣华等[14]在1998年首次报道用GCMS测定氯氮平及其去甲代谢产物。以三氟乙酸酐作酰化剂，并以安定为定量内标，氯氮平的线性范围为1～128μg/L，最低检测浓度为0.1μg/L，回收率大于83%，相对标准偏差小于10%。周海梅[15]等在2003年建立固相萃取－气相色谱－质谱（SPE－GC－MS）方法测定血液及肝中氯氮平含量。该方法以SKF525a为内标，氯氮平的检测限为0.05 ng，线性范围为0.5～100 ng，平均回收率为90.1%。王琦玮[16]等在2007年采用固相微萃取（SPME）和GC－MS联用技术，以洛沙平为内标建立了测定人血浆中氯氮平浓度的方法。标准曲线在5～1000 ng/mL浓度范围内呈线性关系，氯氮平的定量检测限为0.1 ng/mL，平均相对回收率高达94.6%～98.6%。此法操作简便、灵敏度高，适于氯氮平急性中毒的检测；但由于萃取头的萃取面积很小，达到平衡时所萃取药物的绝对量也较少，因此使用SPME法时药物的提取回收率不高，所以需要选择与待测药物化学性质相似的化合物作内标，使两者的提取回收率相似并保持固定比值，这样就不会影响定量分析的准确性。曹洁[17]等在2015年将中空纤维膜－液相微萃取(HF－LPME)与气相色谱－质谱联用技术(GC－MS)相结合，建立血液中氯氮平的检测方法。萃取时选用聚偏氟乙烯中空纤维，血液中氯氮平浓度在0.01 mg/L～5 mg/L范围内，线性关系良好，检出限为0.01 mg/L，加标回收率为92.3%～98.8%。该方法操作简单，所需有机溶剂少，富集效率高，可避免残留和交叉污染，适于血液中氯氮平的检测。与TCL相比，GC－MS具有灵敏度高、分离效果好和分析速度快等特点，此法不但适用于氯氮平的定性分析，也适合进行定量分析。

2.4 高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法是基于混合物中各组份对两相亲和力的差别进行组份分离，在复杂物质检材的高效、快速分离分析中发挥着十分重要的作用，有着其他方法难以取代的地位。HPLC由于其强大的分离能力在氯氮平的检测中被广泛应用。王泽人[18]等在1986年首次建立HPLC-UV方法测定氯氮平的血药浓度，血清样品用乙醚液液萃取，以安定作为定量的内标物。氯氮平与其代谢产物和内标等出峰快，分离好。该方法最低检测浓度为5 ng/mL，回收率为100.8%，CV＜5.4%。李琰[19]等在2018年、李庆丽[20]等在2019年均报道过用HPLC测定氯氮平的浓度，他们均采用液液萃取的方式处理样品，以内标法或外标法来定量。而张文英[21]等在2013年、沈广虎[22]等在2014年则是采用固相萃取的方式处理样品，其中张文英等、沈光虎等选用的是在线固相萃取，其余人等选用的离线固相萃取。不论选择哪种萃取方式，在配合HPLC测定氯氮平含量时都得到了较为满意的结果。余自成[23]在1998年用HPLC测定人血清中氯氮平浓度时，选用安定为内标，血清样品用75%三氯乙酸沉淀蛋白后直接进样检测，氯氮平的最低检测限为33.6 ng/mL，线性范围50.4～1176.0 ng/mL，平均回收率100.9%～102.9%。该方法利用三氯乙酸沉淀蛋白后直接进样，避免了有机溶剂萃取、转移、吹干等繁琐操作；此外，用高浓度三氯乙酸为蛋白沉淀剂，可保证用较少量沉淀剂就能完全沉淀蛋白，避免沉淀剂用量过多对样本的稀释，从而保证了直接进样的检测灵敏度。金士萍[24]在2015年用HPLC法测定人血浆中氯氮平浓度时，先碱化血浆然后用乙醚液液萃取再分出醚液后离心，最后上清液过固相萃取小柱。此法测定的氯氮平含量亦较为准确可靠。邵红霞[25]等在2016年采用前处理柱（MAYIODS柱）联合在线柱切换高效液相色谱法，血清直接进样，分析血清中氯氮平的浓度。该方法一方面省去了繁琐的预处理，另一方面避免生物样品在预处理过程中成分改变或损失而影响检测；氯氮平检测浓度在75～1200 ng/mL范围内呈良好线性关系，最低定量限为15 ng/mL，方法回收率93.0%～110.5%。

HPLC检测氯氮平快速灵敏、选择性好，但此方法需要专业的化学从业人员进行操作，不适于作为氯氮平现场分析的方法。

2.5 液相色谱-质谱联用法(LC-MS)

与HPLC相比，使用HPLC-MS对氯氮平进行检测，兼有HPLC的分离能力和MS的高灵敏度和特异性。秦群[26]等在2004年建立HPLC-ESI+-MS法测定氯氮平血药浓度，血浆用C18固相萃取小柱进行萃取，以卡马西平为定量内标，氯氮平最低检测限为0.2ng/mL，线性范围为20～2000ng/mL，方法回收率大于95%，日内、日间精密度（RSD）均小于10%。国外则是由Aravagiri[27]在2001年、Tonooka[28]在2018年报道用HPLC-ESI+-MS法测定氯氮平的血药浓度。此外，王俊伟[29]等在2011年、王玮[30]等在2018年、陈颖[31]等在2020年又相继发表以HPLC-MS/MS法检测生物样本中氯氮平浓度的文章。由于串联质谱分析仪的灵敏度和选择性远高于单级质谱分析仪，故目前多采用高效液相色谱-串联质谱仪对生物检材中的氯氮平进行分析。

3 光谱分析法

光谱分析法是基于电磁辐射能与待测物质相互作用后，由产生的辐射信号确定待测物质组成和结构的分析方法。在研究待测物质组成、结构表征等方面具有其他分析方法难以取代的地位，因此对氯氮平的光谱特征研究也是非常有意义的。

3.1 紫外分光光度法

又称紫外吸收光谱法。根据物质对不同波长的紫外线吸收程度不同而对物质组成进行分析的方法。杨杰[32]等在1990年应用紫外分光光度法，对6名精神病患者口服氯氮平后的唾药浓度进行测定，药物在体内的经时过程符合二室开放模型。在相同条件下的同一时间测定氯氮平的血药浓度与唾药浓度之比值为1:0.28，两种浓度呈正相关。然而李焕德[33]在1991年对此法提出了质疑，他结合自己的临床经验认为氯氮平在唾液中的浓度及用药剂量等方面均达不到文中的数据。

3.2 电荷转移光度法

徐变珍[34]等在1998年以氯氮平作为电荷给体，7,7,8,8－四氰基对二次甲基苯醌(TCNQ)作为电子受体，用分光光度法研究了它们之间形成电荷转移(CT)络合物的条件。结果表明在丙酮介质中，二者于45℃水浴中恒温1 h即可形成1:1的络合物，其最大吸收波长为743nm，0～17.5μg/mL范围内呈线性关系，表观摩尔吸光系数ε=1.60×104L·mol－1·cm－1，方法的相对标准偏差小于1%(n=8)，回收率为99%。该方法得出的结果可靠，为氯氮平含量的分析和测定提供了新的手段。

4 毛细管电泳法

毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离管道，高压电场为驱动力的液相分离分析技术。由于毛细管电泳法具有效率高、分析时间短、微量、价格便宜等特点，在氯氮平检测分析中受到越来越多的关注。张石宁[35]等在2000年首次建立用毛细管区带电泳快速测定血清中氯氮平含量的方法。取33.5 mmol/L磷酸盐缓冲液(PH=6.47)，用紫外检测器在254 nm波长处检测，以外标法定量，线性范围0.1～10μg/ml，最低检测限0.1 μg/ml。平均回收率(97.47±2.8)%。日内与日间RSD分别为2.63%和3.81%。周大炜[36]等在2004年采用毛细管电泳－迎头分析模式体外实验测定了人血清白蛋白溶液、人血浆、兔血清和血浆样品溶液中游离氯氮平的浓度。毛细血管带电泳法是快速测定人血清中氯氮平含量的较好方法，但是毛细管电泳法目前仅适用于在实验室中进行分析，不适合氯氮平的现场检测。

5 电化学分析法

电化学分析法是依据物质的电化学性质来测定其组成及含量的分析方法，该方法以其高灵敏度、高选择性和操作方便等特点，在抗精神病药物检测中得到广泛应用。梁宁刚[37]等在2018年制备了三维石墨烯/L－胱氨酸修饰电极，并用于氯氮平的分析研究中，建立了一种测定氯氮平含量的电化学新方法。目前运用电化学方法进行检测研究的多采用二维石墨烯[38,39]，但是大部分的方法仅适用于实验室检测，未来在技术改进的情况下具有潜在的应用前景。

6 展望

目前对氯氮平的检测方法有很多，大部分仅局限于实验室的检测，而直接用于现场检测的较少。在氯氮平的检测方法中，实现对氯氮平的现场检测将对氯氮平血药浓度的医学监测及自杀、投毒等刑事案件的侦破具有重大的意义。生物检材中氯氮平及其代谢物的分析检测受到相关从业者的关注，近年来科学家一直在寻找简单、灵敏、快速的方法来检测这些滥用药物。虽然随着仪器、设备性能不断改善，分离技术不断提高，生物检材中氯氮平及其代谢物的检测方法逐步向自动化、快速化和现场化发展，但每种检测手段都依然存在着局限性。因此建立快速、准确、高机动性、可现场检测的体系仍是未来的努力方向。