脊髓性肌萎缩症携带者产前筛查的几种实用技术

李吉明 邢清和

(上海市妇幼保健中心，上海 200062)

脊髓性肌萎缩(spinal muscular atrophy，SMA)是发病率居于第二位的严重染色体隐性遗传病，仅次于囊性纤维病，属于遗传运动神经元病，病理机制主要是通过脊髓前角细胞的变性，导致对称性近端肌肉无力[1]。

SMA由Guido Werdnig首次报道于1891 年，具有明显的表型异质性，根据发病年龄不同，SMA被分为5种亚型[2]，其中O型为婴儿型，呼吸衰竭是早期关注点，一般存活不超过6个月。Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型均为儿童型，Ⅰ型为严重型，也最常见，占SMA患者45%，多数由于SMN1基因同源缺失引起，一般患儿在出生后6个月内发病，2岁前因呼吸衰竭死亡。Ⅱ型为中度型，约占患者中20%，Ⅱ型患者6～18个月内患病，存活在2年以上；大约30%患者为Ⅲ型，轻度型，18岁内患病，预后良好，可长期存活。Ⅱ、Ⅲ型SMA几乎是由于SMN1至SMN2的基因转化所致，故轻型SMA患者携带有较多的SMN2拷贝[3，4]。Ⅳ型为成人型，发病年龄多在18岁及以上，约占5% ，发病缓慢、肢体近端无力逐渐加重、肌肉萎缩，可伴肌束震颤，本型预后良好，基本不影响寿命。

遗传流行病学研究显示，人群中SMA致病突变的携带者频率高达1/54[5]～1/40[6]。基于我国人群的大样本量研究显示，我国人群中SMA致病突变的携带者频率和世界平均水平近似，介于1/54[7]和1/84[8]之间，以此估算，每10 000～25 000新生儿中就有1人患病。由于遗传学检测技术的快速发展，各种SMA的检测方法也快速涌现，基于人群的SMA致病突变筛查已在多个国家开展，本文仅对常用的脊髓性肌萎缩症携带者筛查方法，希望为后续大规模做筛查提供借鉴。

1 SMA的遗传学机制

1995年，Lefebvre等[9]确定运动神经元存活基因(SMN)是SMA的致病基因，SMN位于染色体5q11.2-q13.3，编码全长294个氨基酸、分子量为38kDa的蛋白质，物种间高度保守，全身组织普遍表达,在脊髓运动神经元中SMN表达丰度最高[10]。SMN基因包含2个高度同源的反向基因：近端粒的SMN1或SMNt(OMIM#600354)和近着丝粒的SMN2或SMNc(OMIM#601627)。SMN1和SMN2序列只有5个核苷酸差异，一个在内含子6，一个在外显子7，内含子7中有2个，外显子8中有1个[11]。7号外显子840位置的转换(C→T)是一个重要功能突变，该突变是SMN1和SMN2编码序列唯一的突变，携带该突变的SMN2只能产生野生型水平的约10%的完整蛋白，且稳定性较差，功能下调，而SMN1是产生SMN完整功能蛋白的主要基因[12]。SMN1突变可导致SMA表型，突变的主要形式是SMN1部分外显子缺失或是基因全长缺失，而SMN2拷贝数数量则和SMA的严重程度有关[13]。NAIP的拷贝数与SMA严重性也有一定关联，NAIP基因拷贝数变化可以影响SMA病情严重程度[14]。

SMN1基因第7、8 外显子(E7、E8)是突变热点，目前认为在超过95%的Ⅰ～Ⅲ型[15]SMA 患者中存在SMN1基因纯合缺失，具体表现为SMN1 E7、E8 序列同时缺失，或仅有SMN1 E7序列缺失，只有约5%的患者是由SMN1发生其他微小突变、杂合缺失或SMN1向SMN2转化导致的SMN1缺失[16，17]。

2 携带者类型

SMN1野生型为双拷贝，但也有人为不同程度的拷贝数重复，拷贝数可从重复一次到几次不等[18]。SMA纯合缺失的患者SMN1拷贝数为0。

SMA携带者主要有4种基因型：SMN1 基因在一条染色体上的顺式重复和反式缺失的复合体“2+0”型[19]；2条同源染色体上，1条染色体上有1拷贝野生型的SMN1基因，另1条缺失SMN1基因的为“1+0”型；1条染色体上有1拷贝SMN1基因，另1条SMN2基因发生微小突变的“1+1m”型；1条染色体上有2拷贝SMN1基因，另1条SMN1基因发生突变的“2+1m”型；“1+0”型携带者最常见，约占95%，其他约占5%[20]。因而对SMN1拷贝数进行检测，就可以筛查出大部分SMN1拷贝数为1的携带者和拷贝数为2以上的健康人。因而通过检测SMN1拷贝数可筛查区分健康者和携带者。

SMA携带者没有任何临床表现，如果父亲和母亲均是携带者，则后代有25%的概率获得2个有缺陷的基因拷贝而显示SMA表型。

3 脊髓性肌萎缩症携带者常用筛查方法

3.1 多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA) MLPA是Schouten等于2002年发明的一项基因诊断新技术，主要用于基因片段缺失/重复、染色体非整倍体等的检测，可检测出基因纯合缺失、杂合缺失和拷贝数增加等基因拷贝数量的变化[21]。

MLPA检测包含靶向SMA基因关键区域的多个探针，特异性探针与SMN1、SMN2基因杂交后进行扩增，根据扩增产物和参照序列的比值，评价SMN1和SMN2的拷贝数。无论是SMN1纯合或杂合缺失还是向SMN2的转化都可检测，筛查结果可靠，已被许多国家管理部门批准用于临床检测。MLPA检测基本步骤如下，经过DNA变性、探针杂交、连接和荧光引物 PCR 扩增，进行片段分离和数据分析，整个过程耗时24h左右。

丁宇等[22]通过对3名疑似患者和其父母外周血标本，提取基因组DNA，应用MLPA试剂盒进行分析，MLPA图谱可直观显示SMN1基因与SMN2基因信号峰值的变化。将每个样本中每对探针产物峰的相对峰面积，再除以标准对照样本中相对应的产物峰的中位值，即得到比值，也就是该序列的相对拷贝数，最后校正后得到绝对拷贝数。结果不仅诊断出患儿SMN1基因的7号和8号外显子的拷贝数皆为0，为纯合缺失，同时也检测出3例患儿父母SMN1基因的7号和8号外显子的拷贝数属于1拷贝范围，属于杂合缺失的携带者。

罗福薇等[23]使用MLPA方法对15 例患者的父母都检测出外显子7 和外显子8 杂合缺失，同时检测的44 例无SMA家族史的健康成人，未发现SMN1基因外显子7 和8 的缺失，很好地证实了MLPA对SMA携带者的筛查作用。

但MLPA对杂质污染极其敏感，在制备样品和操作该技术时需要非常小心，虽然最低20ng DNA可用于检测，但是100～200ng DNA模板是临床检测推荐的模板量[24]。

3.2 PCR-变性高效液相色谱(PCR-denaturing high performanceliqu id chromatography, PCR-DHPLC) DHPLC是一种新的高通量筛选DNA序列变异的新技术，这一技术最先由美国Stanford大学Oefner及Underhill等于1995年报道，其特点是高通量、自动化程度高、灵敏度及特异度均较高，更适合大片段DNA的筛查，检测快速，价格相对低廉，检测结果以图表显示，方便判断[25]。

PCR-DHPLC已经成为了SMA筛查的主流方法，龚波等[26]和谭建强等[8]都用此方法做了大规模携带者筛查。主要都是应用多重PCR结合DHPLC进行SMN1和SMN2基因拷贝数的检测，首先通过PCR扩增目标基因，再采用DHPLC半定量方法检测。 PCR-DHPLC图形前2个峰是内参峰，后2个峰是SMN2、SMN1，待测样本SMN1、SMN2拷贝数通过和正常对照结果的比较计算得出，筛查出SMN1拷贝数为1的脊髓性肌萎缩症携带者。

3.3 荧光定量PCR 荧光定量PCR又称qPCR，是一项常见分子生物学实验技术。对核酸进行定量分析，应用广泛，用于检测基因的表达量。可对片段的拷贝数变异(copy number variation，CNV)进行分析，对基因进行分型，对DNA要求低，适用于组织、新鲜血液DNA样本和干血斑DNA样本[27]。其原理为通过监控反应体系中荧光强度的变化，记录检测荧光达到阈值时的循环数(Ct值)。理论上说，起始模板量和Ct值密切相关，因此我们通过判读Ct值对样本进行定量。

任晨春等[28]对临床确诊为SMA的5例患儿及其父母同时用定量荧光聚合酶链反应(quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR)方法检测，4例患儿SMN1的E7、E8均表现为纯合缺失，其父母都表现为SMN1 E7、E8均杂合缺失的携带者。1例检测出SMN1 E7纯合缺失，E8杂合缺失的患者，其母亲检测出基因型为SMN1 E7、E8的杂合缺失，父亲仅表现为SMN1基因E7的杂合缺失，E8无缺失改变。QF-PCR方法与MLPA法检测的结果比对，完全一致。

荧光定量PCR对于SMN1基因的检测，主要是比较标本中SMN1基因与健康对照的相对量以推定其拷贝数，所以采用无需标准品的相对定量方法。由于缺失1个SMN1基因模板与野生型之间基因的拷贝数差异仅为1倍，体现在Ct值上的变化非常小，所以每次检测标本时一般同时检测3例健康对照标本，通过公式计算得到目的基因相对参比基因的拷贝数。这种目的基因相对定量模式，无需制备标准曲线，可灵敏地检测出基因拷贝数的差异[29]。

目前国内已经有几家公司的荧光定量检测试剂盒已经取得了CFDA的证书，检测方便，通过荧光定量PCR 扩增就可检测，通过标准化判读，总共2～3h内完成实验，得到结果。

3.4 微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR) 数字PCR(digital PCR，dPCR)是新型分子诊断技术，通过有限稀释将样本分到许多独立的区室，每个区室最多包含1个拷贝的PCR模板，大多数区室并不包含PCR模板分子。PCR反应时，多个区室同时平行独立扩增。扩增完成，通过荧光信号的有无，计数阴性和阳性区室的数量，可实现绝对定量。现已在遗传病分子诊断中使用，可准确检测0～3拷贝的SMN1基因和0～5拷贝的SMN2基因。dPCR方法非特异性扩增少，检测SMN1和SMN2基因拷贝数CV值优于TaqMan探针法qPCR技术检测的CV值[30]。

Vidal-Folch等[4]用ddPCR方法检测干血斑样本，通过特殊设计的引物和探针，不仅能筛查SMA携带者，还能筛查出一定的SMN1“2+0”基因型。

dPCR对DNA要求低，干血斑就能检测，拷贝数检测准确，不易被PCR反应抑制剂所干扰。同时检测成本和其他方法相当。

4 总结

脊髓性肌萎缩作为常染色体隐性遗传病，人群携带率较高，父母双方都是携带者，生育患儿的概率有25%，50%可能会生育携带SMA致病基因的子女。临床上还没有行之有效的治疗方法，支具或矫形器进行干预可延缓疾病进展，相关药物直到2019年2月底，用于治疗5q SMA的反义寡核苷酸药物诺西那生钠注射液(Nusinersen，曾用名 IONIS-SMNRX，商品名Spinraza)在我国获批，虽然上市后国内SMA患者无药可用的局面被打破，但普通患者家庭能否承担药物费用仍存疑问，且需反复鞘内注射，终身用药且费用昂贵[31]。

产前筛查利用分子遗传筛查技术，可以从源头降低脊髓性肌萎缩的患儿出生，是一种经济有效的出生缺陷控制方法。可行的筛查方式是对备孕妇女进行携带者筛查，如判断为携带者，则对其配偶进行携带者筛查，如果夫妻双方均为携带者，则需在妊娠时进行产前诊断，根据诊断结果配合遗传咨询采取临床干预措施，防止受检者生出SMA患儿。

MLPA分析作为SMA分子诊断的金标准技术，诊断性高，但是仪器大型，实验室配置不普遍，且运行易受杂质干扰、操作复杂且耗时长。PCR-DHPLC技术敏感度高，特异性好，成本低廉，是目前大规模人群样本筛查常用的技术。荧光定量PCR检测技术，所需荧光定量PCR仪器，实验室配置比较普遍，实验数据判别方便，同时试剂有CFDA证书。荧光定量PCR技术成本低、灵敏度高、检测结果准确可靠，同时操作简单，实验步骤少，无需开盖检测等特点，可作为新型大规模筛查方法。ddPCR属于绝对定量，拥有高灵敏度、高准确性，实验过程不易被PCR反应抑制剂干扰，对DNA要求低，干血斑就能检测，作为携带者筛查，未来有很大的利用空间。

对于不同样本类型检测方面，荧光定量PCR和ddPCR可以使用干燥血斑DNA进行检查，但是有发现干燥血斑DNA是单链的、高度碎片化的，并且容易被RNA污染，不太可能支持精确测定拷贝数。所以有条件建议用新鲜血液DNA进行携带者筛查，以得到更准确的结果[32]。

上述的这些筛查技术还存在一些弊端，会漏检约5%的特殊突变携带者，如“2+0”型、“2+1m”型、“1+1m”基因型。后续提高筛查准确率，进一步全部筛查出所有携带者还是需要解决的问题。

另外如何宣传和推广SMA基因筛查也是个社会问题。只有多方努力，加强宣传力度，提高认知率，同时筛查做到检出率高，结果准确，价格合适，大众才能更好地接受检测，从而让SMA携带者筛查得到更大的普及，降低SMA的患病率。