超声内镜引导下细针穿刺联合基因检测对胰腺实性占位病变诊断意义的研究进展

徐婷婷 陈平

作者单位：内蒙古医科大学附属医院消化内科，内蒙古 呼和浩特 010030

胰腺癌是消化系统恶性程度最高的肿瘤之一，是全球第七大癌症相关死亡原因，与其他癌症不同的是，胰腺癌的发病率持续上升，生存率几乎没有改善[1]。胰腺癌患病率不断提升的同时，死亡率也在升高，主要原因是胰腺癌早期诊断困难，一旦出现临床症状，患者大多已属晚期或者转移。胰腺早期诊断困难与胰腺的位置及特点相关，胰腺在腹腔的位置较深，其前有胃、横结肠、大网膜等腹腔脏器遮盖，且胰腺同时具有内脏器官感觉定位模糊的特点，所以早期病变不易诊断。胰腺肿瘤的影像特征不典型，通常很难通过影像特征诊断，特别是直径小于2cm 的肿瘤，很难发现和诊断。目前对胰腺肿瘤的检测，内镜超声检查是可用的最敏感的成像方法。超声内镜引导下细针穿刺活检也被证明是一种安全有效的胰腺肿瘤组织取样方法[2]。 在胰腺实性占位中，胰腺导管腺癌及其变异体约占所有胰腺肿瘤的85%[3]。因为胰腺导管腺癌和反应性非肿瘤性胰管之间的细胞学特征重叠，所以区分它们是困难的，特别是在小活检和细针穿刺中。有研究表明超声内镜引导下细针穿刺（EUS-FNA）胰腺肿块的Kras 突变与恶性肿瘤相关，可能有助于区分良恶性[4]。

研究表明,EUS-FNA 是鉴别诊断胰腺肿块的最佳方法。但EUS-FNA 的灵敏度只有65%～95%，尚需改进[5]。EUS-FNA 提供了可视化下采样胰腺病变的机会。通过EUS-FNA 获得胰腺占位病变的抽吸物，可进行组织、细胞、分子水平的研究，所以有足够的组织可以进行HE 染色、免疫组织化学染色、流式细胞术以及基因分析[6]。对于怀疑为胰腺癌的病例，建议将EUS-FNA 作为一线手术。EUS-FNA 对组织采集的诊断准确率普遍较高，尤其对小病灶的诊断。诊断肿瘤需要组织学检查来评估组织结构以明确肿瘤病理类型。有时EUS-FNA 采集到的组织不足以行细胞学和组织学检查，这时我们可以通过分子分析以明确诊断，因为胰腺肿瘤的治疗策略和预后因组织学和肿瘤分期不同有较大差异。

实性占位包括胰腺癌肿块、胰腺内分泌肿瘤及胰腺炎，其中胰腺炎包括急性胰腺炎的假性囊肿及慢性胰腺炎的实性包块。在影像学上有时难以鉴别，通过EUS-FNA 取得组织，完善病理及免疫组化及基因分析可以明确诊断，以提供准确的治疗方案及患者预后。

1 胰腺癌

国外一项研究表明，胰腺癌预后较差，未来10年将会成为癌症死亡的第二大原因，5年生存率受发病时疾病阶段的影响，转移癌的5年生存率为2.9%，区域性病变为12.4%，局部病变为37.4%。大多数病例发现时已是晚期,且胰腺癌转移较快[4]。国际癌症控制联盟(UICC)称IA 期患者的5年生存率为68.4%，0 期患者的5年生存率为85.8%[7]。高危个体的胰腺癌筛查应该从50 岁开始，或比家族发病的初始年龄小10 岁开始。遗传性胰腺炎的CKDN2A 和PRSS1 突变携带者应在40 岁时开始筛查，在Peutz-Jeghers 综合征患者中应在35 岁时开始筛查[4]。随着技术的进步，CT 对胰腺癌的检测和分期的准确性不断提高，所以CT 仍然是可疑病变初步评估的基础。自从1992年引入EUS-FNA以来，胰腺病变已经可以直接、准确和安全地采样。目前报道的EUS-FNA 在诊断胰腺癌中的敏感性、特异性和准确性有很大的差异，分别为64%～94%、71%～100%和78%～95%[8]。下面讨论目前研究较多的与胰腺实性占位有关的分子标志物。

1.1 KrasKras 是多种信号通路中的关键蛋白。Kras 基因突变抑制了水解GTP 的能力，使蛋白质具有结构活性。在胰腺导管腺癌中，Kras 突变是一个早期和起始的事件。90%以上的低度恶性胰腺癌含有致癌的Kras 突变，95%的胰腺癌存在Kras 基因突变，但Kras 在实体假乳头状肿瘤、神经内分泌胰腺肿瘤、浆液性囊腺瘤中没有改变[9]。此外，Kras 在导管内乳头状粘液瘤中经常发生突变。正常胰腺导管上皮向胰腺癌的多步骤进展涉及典型癌基因的改变，最显著的是Kras 癌基因，这对胰腺导管癌的发生至关重要。通过基于聚合酶链式反应(PCR)的分析和DNA 测序，近95%的胰腺癌患者的手术标本中发现了Kras 点突变。Kras 最常见的突变点位于第12 个密码子，但第13、59、61、63 位密码子也有突变，几个密码子均应检测才能提高准确率。Kras 突变虽然对胰腺导管腺癌是敏感的，但不是完全特异的，已有报道称在慢性胰腺炎及多达三分之一的导管多灶性增生性疾病的患者中有Kras 突变[8]。有研究表明[10]，细胞病理学和Kras 基因突变检测的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确性分别为87%、100%、100%、54%和89%，联合检测的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为93%、100%、100%、68%和94%。可见当细胞病理学联合基因检测可增加诊断的准确性。胰腺癌患者的5年存活率仅为5%，被诊断为早期可切除肿瘤的患者的5年存活率超过20%。诊断方法的进步可能有助于及时发现胰腺癌并改善预后。

1.2 Smad4Smad4 在胰腺癌中缺失时也被称为DPC4，是位于染色体18q21 的另一个重要的肿瘤抑制基因。p16 和DPC4 在几乎95%的浸润性胰腺癌中失活，因此有可能作为分子标志物使用。所有的基因突变事件都会对细胞周期的控制产生不利影响，使缺陷细胞能够增殖。Smad4 肿瘤抑制因子是Smad 蛋白家族的成员，Smad 蛋白家族在转化生长因子-β(TGF-β)的细胞内信号转导中起着至关重要的作用[9]，Smad4(DPC4)基因位于染色体18q 上。许多癌症有Smad4 突变，大约50%的胰腺癌中该基因是失活的。在胰腺癌中，Smad4 的缺失与预后不良和转移风险增加有关[10]。近期，来自美国的一项研究对早发胰腺癌（年龄≤55 岁）和平均发病年龄胰腺癌（年龄≥70 岁）患者进行全外显子测序发现，在早发胰腺癌患者中Smad4 突变率明显较高[5]。

1.3 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A（CDKN2A）CDKN2A 基因位于染色体9p21 上，是编码p53 蛋白激活因子(p14ARF)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(p16INK4 蛋白)。该基因参与了细胞增殖的负调控。CDKN2A 基因的突变与患多种癌症的风险增加有关，并且经常在癌细胞系中可观察到。CDKN2A 在95%的散发性胰腺癌中失活，是家族性胰腺癌的致病基因。观察发现，胰腺癌患者中CDKN2A 的胚系突变很少见(0.6%)，但携带CDKN2A 突变的患者更有可能报告有胰腺癌和黑色素瘤的家族史[10]。

1.4 胰岛素样生长因子IImRNA 结合蛋白3(IMP3)IMP3 是一种在胚胎发育过程中表达的致癌胎儿蛋白，在正常成熟组织中几乎是沉默的。IMP3 可能在mRNA 的运输和稳定、定位、细胞生长和细胞迁移中发挥重要作用。IMP3 在许多恶性肿瘤中都有表达，包括肾细胞癌、卵巢癌、尿路上皮癌、肺癌、结直肠癌和胰腺导管腺癌。最近的研究表明，胰腺导管腺癌中IMP3 的过度表达与预后不良密切相关，IMP3 可能是胰腺导管腺癌潜在的治疗靶点[11]。IMP3 在胰腺导管腺癌、恶性导管内乳头状粘液瘤、良性导管内乳头状粘液瘤和慢性胰腺炎中的阳性表达率分别为72.3%、50%、20%和0。在EUS-FNA 标本中，细胞组织学分析的敏感性、特异性和准确性分别为80.8%、100%和85.0%。恶性病变中IMP3和p53 阳性表达率分别为80.8%和44.9%，良性病变中分别为0 和5%。结合IMP3 免疫组织化学染色，细胞组织学检测的敏感性、特异性和准确性分别提高到87.9%、100%和90.8%[11]。IMP3 在89% 的胰腺癌中表达，而在良性病变中不表达。IMP3 蛋白表达增强与胰腺癌分期有关。IMP3 在所有局部癌和85%的晚期胰腺癌中均有表达。在局部晚期癌组中，IMP3 的阳性表达率为88%，在远处转移组中的阳性表达率为83%。有研究表明，其敏感性为89%，特异性为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为63%[12]。相对于非恶性胰腺组织，IMP3 在恶性胰腺组织中的过度表达是有充分证据的。此外，在分化较差的3 级胰腺肿瘤中发现IMP3 的高表达。IMP3 诊断胰腺癌的敏感性为91.2%，特异性为86.7%，阳性预测值为96.2%，阴性预测值为72.2%，总准确度为90.3%[13]。

1.5 热休克蛋白27 (HSP27)HSP27 属于低分子量热休克蛋白家族的成员，是一个涉及到药物抗性、细胞生长、细胞凋亡、肿瘤的发生和转移等功能的重要蛋白，其中p-HSP27 过表达患者的吉西他滨耐药率明显增高。当设定p-HSP27(Ser82)检出率为51.6%时，检出率>51.6%组生存率明显降低，且用药时间较短。EUS-FNA 标本中HSP27 的表达可作为预测吉西他滨敏感性的指标[14]。有报道称，与5-氟尿嘧啶（5-FU）相比，吉西他滨在局部晚期或转移性胰腺癌患者中具有更长的生存期和临床受益[15]。

1.6 P53P53 蛋白是细胞周期调控、凋亡过程和维持基因组稳定性的关键因子。TP53 基因的突变导致P53 的正常功能失活，并增加了蛋白质的稳定性。这些改变在几乎所有人类癌症中都很常见，宇宙数据库中49%的胰腺癌显示出TP53 突变[16]。肿瘤抑制基因P53 被翻译成一种调节其他调控蛋白转录的产物，如细胞周期素D/CDK2 家族的抑制因子γ 蛋白P21[17]。

1.7 骨桥蛋白(OPN)OPN 是一种磷酸化蛋白，能激活诱导癌细胞存活和转移的途径。OPN 是一种分泌型糖蛋白，既是细胞外基质成分，又是一种细胞因子，在包括胰腺癌在内的侵袭性癌症中经常过度表达，在细胞黏附和迁移、炎症反应、凋亡等方面发挥多种功能。OPN 的过度表达与转化细胞系的转移潜能有关，转移性癌症患者血液中OPN 浓度显著升高[18]。

1.8 MUCMUC 是一种高相对分子质量的糖蛋白，其多肽链上含有富含苏氨酸和丝氨酸的结构域。其糖基化的改变已经在癌症中被描述，且在癌症的发生和肿瘤侵袭中可能是重要的。虽然MUC7 在胰腺癌和慢性胰腺炎中的表达差异无统计学意义，但MUC7 阳性率为73%，可作为恶性病变的潜在标志物，尤其是在胰腺癌中[19]。对于细胞学诊断困难的病例，如与肿瘤肿块相关的促结缔组织增生反应或坏死，或在慢性胰腺炎背景下局灶性病变生长的病例，它可能是有用的。

1.9 S100PS100P 属于钙结合蛋白S100 家族，是一种由95 个氨基酸组成的蛋白质，最先从胎盘中提纯出来。最近的研究发现，一些与S100 相关的蛋白，包括S100P、S100A6 和S100A4 在胰腺癌中高表达[12]。除胰腺癌外，S100P 在多种肿瘤中也有表达。有研究发现，S100A6 和S100A4 在胰腺癌中的阳性表达率分别为98%和73%，而在良性导管中，这两种标志物也有20%的核阳性或胞浆阳性，因此两种标志物对胰腺癌的诊断都不如S100P。S100P 诊断胰腺癌的敏感性为96.4%，特异性为93.3%，阳性预测值为98.2%，阴性预测值为87.5%，总准确度为95.8%[13]。

1.10 其它生物标志物除了以上提到的分子标志物以外，CTNNB1 基因突变是胰腺实性假乳头状瘤的分子标志，在这些类型的肿瘤中，CTNNB1 突变是唯一检测到的分子改变。GNAS 基因突变在大约60%的导管内乳头状粘液瘤和一些与导管内乳头状粘液瘤相关的侵袭性胰腺癌中发生突变。已有研究发现绝大多数(约90%)的导管内乳头状粘液瘤中至少有一个GNAS 或Kras 基因发生了突变[10]，P16 抑癌基因产物与cyclinD/CDK4 或CDK6 复合物结合，从而在G1 控制点调节细胞周期进程[20]。Plat 在胰腺外分泌癌的血管生成和肿瘤的发生发展中起着重要作用，有侵袭性。KRT7 蛋白被认为是正常胰腺管上皮细胞在细胞分化中起作用的标志物[21]。

2 胰腺内分泌肿瘤（PET）

PET 是来源于胰腺多能神经内分泌干细胞的一类肿瘤，也称为胰岛细胞瘤或胰腺神经内分泌肿瘤。根据肿瘤是否有功能分为两类：一类为有内分泌功能的，根据其分泌的主要激素进行命名，在临床上出现一系列相应症状，其中胰岛素瘤和胃泌素瘤最为常见，而其他类型则相对罕见；另一类是血清激素正常，且不伴有明确临床症状的肿瘤，称为无功能性的胰腺内分泌肿瘤。主要因患者出现腹部包块或者出现肿瘤压迫症状时被发现。与常见的胰腺癌相比，神经内分泌肿瘤的细胞学及分子生物学标志物研究的相对较少。因为PET 是一种罕见的肿瘤，与胰腺粘液性囊性肿瘤（MCN）相似。PET 的不良预后与肿瘤>3cm、高Ki-67 指数、高有丝分裂率、DNA 突变量和特异性DNA 改变有关[22]。原发性胰腺淋巴瘤是一种罕见的疾病，非霍奇金淋巴瘤发生在胰腺的几率不到1%。原发性胰腺淋巴瘤可以通过化疗很好的控制，达到长期缓解的目的。EUS-FNA 结合流式细胞术对诊断非霍奇金淋巴瘤有很高的敏感性（84.6%），联合用流式细胞术提高了特异性（100%）[23]。

2.1 MEN-1MEN-1 基因定位于11q13，其在进化过程中高度保守，编码蛋白称为menin，menin 参与转录调控，维持基因组稳态性并参与增殖，90%带有MEN-1 基因胚系突变的患者终会发展为多发内分泌肿瘤1型，另外部分散发型胰腺神经内分泌肿瘤也会出现MEN-1 基因突变[24]。

2.2 m-TORm-TOR 是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，m-TOR 通路参与物质代谢、细胞凋亡、自噬、增殖和血管生成。m-TOR 信号通路相关基因突变导致其持续激活与胰腺神经内分泌肿瘤的发生发展密切相关。m-TOR 能对胞外包括胰岛素、生长因子、氨基酸、葡萄糖等多种刺激产生应答，主要依赖PI3K/AKT/m-TOR 信号通路途径实现对细胞生长，细胞周期等多种生理功能的调控。

3 胰腺炎

3.1 急性胰腺炎的假性囊肿急性胰腺炎是消化系统常见的疾病，此病发病急，病情危重。近年来随着人民饮食种类的丰富和生活生产的发展，高蛋白质饮食较前明显升高，随之急性胰腺炎的发生率明显上升。而胰腺假性囊肿是急性胰腺炎的常见并发症。大多数胰腺假性囊肿可自行吸收，仅有一小部分存留下来，这可能会并发感染、出血、消化道瘘以及腹腔积液等，进一步加重患者病情，甚至可能威胁患者生命。目前研究发现未经特殊治疗的胰腺假性囊肿，一年后86%可以自行吸收，只有3%～9%出现严重并发症，需积极干预[25]。常规的胰腺假性囊肿治疗方法是外科引流及B 超或CT 引导下经皮囊肿穿刺引流术。外科治疗主要包括囊肿胃吻合术、囊肿空肠Roux-en-Y 吻合术、囊肿十二指肠吻合术、胰腺部分切除术及腹腔镜和内镜双镜联合治疗。但因为术后经皮瘘的发生率高，逆行性感染居高不下，且容易给后续外科或内镜治疗造成不必要的麻烦，应用有减少趋势。超声胃镜（EUS）引导下胰腺假性囊肿穿刺是一项开展不久的新技术，其适应证有假性囊肿压迫胃壁或十二指肠壁并明显出现压迫症状，且CT、超声或EUS 显示囊肿壁与胃腔距离不超过1cm[26]。目前内镜下胰腺假性囊肿内引流治疗可以通过放置多种类型引流支架、鼻囊肿引流、内镜下切开引流等方式开展，具有创伤小、恢复快、并发症轻和患者生活质量高等优点。而胰管中断引起的胰腺假性囊肿尚可通过内镜逆行胰胆管造影治疗。同时胃肠壁和假性囊肿间形成的人工瘘可以减少囊肿复发的风险，即使部分研究认为内镜引流不比外科手术和经皮引流术更有效，但因治疗后总体复发率和并发症发生率较低，仍被认为是假性囊肿治疗的一线选择[27]。此外，EUS/EUS-FNA 获得病理组织的同时，还能够观察囊液的颜色，检测穿刺液中的癌胚抗原(CEA)、CA199、淀粉酶、脂肪酶等指标对于提高诊断率有一定的帮助[28]。

3.2 慢性胰腺炎实性包块有研究表明，慢性胰腺炎会增加患胰腺癌的风险，这通常表现为胰头的肿块病变，胰头肿块也会诱发炎性病变。区别炎性和恶性疾病是不容易的，因为二者在临床表现和传统CT腹部表现有相同之处。慢性胰腺炎患者患胰腺癌的风险是普通人群的15 倍。一项荟萃分析显示[3]，5%的慢性胰腺炎患者20年期间可发展为胰腺癌，而且约有70%位于胰头，慢性胰腺炎患者易在胰头出现炎性病变，看起来像肿块，被称为假瘤，术前确认诊断是至关重要的，因为混淆可能会导致良性疾病的胰腺切除或潜在可治愈的病变未行手术治疗。对于胰腺实质正常的胰腺，EUS-FNA 诊断胰腺恶性肿瘤的灵敏度在90%以上，但合并慢性胰腺炎时，灵敏度下降至75%以下[3]。

4 结论

胰腺癌作为恶性程度高的消化系统肿瘤之一，其早期诊断困难，辅助检查的发展使得早期诊断成为可能。EUS-FNA 有30 余年的历史，目前该项技术较成熟，但早期诊断仅依靠该项技术临床效果仍有限，需研究生物分子来辅助诊断，但缺乏强有力的分子标记物用于胰腺癌的早期诊断。通过使用合理组合的生物标记物可以为胰腺实性肿块的分子诊断奠定基础。此外分析胰腺癌发生发展的分子机制有助于确定潜在的新的治疗靶点及判断患者预后。