顺铂耳毒性机制及耳保护策略研究进展

赵宇亮 李熙星

河北医科大学第二医院耳鼻咽喉科(石家庄市 050000)

顺铂（CDDP）是一种含铂的小分子抗癌药物，广泛用于成人癌症（包括乳腺癌，睾丸癌，卵巢癌）和患有实体瘤的儿童[1]，可以极大地提高患者的生存率。然而，顺铂在治疗癌症的过程中，也伴有严重的副作用，包括肾毒性，耳毒性和骨髓抑制等。我们通常将耳毒性定义为药物、化学品或电离辐射作用于耳蜗、前庭等耳器官，引起结构和功能性损伤，诱发听觉功能障碍（耳蜗毒性）或前庭功能不全（前庭毒性）[2]。目前的研究表明，顺铂的耳毒性主要表现为对内耳毛细胞、螺旋神经节和血管纹的损害，同时对内耳内部微环境如内耳淋巴液、内耳细胞代谢和氧化应激过程等产生影响，导致耳蜗感受器及相应的神经末梢损害，出现感音神经性听力损失[3]，并且往往是双侧、永久性听力损失。这就会造成严重的交流障碍，显著降低了患者的生活质量。为了降低顺铂耳毒性，研究人员在探究其作用机制的同时，也针对性的采取多种耳保护策略。下面将对顺铂耳毒性的作用机制和新的耳保护策略做一简要叙述。

1 顺铂的耳毒性机制

顺铂作为一种细胞周期的非特异性药物，可以阻滞细胞周期，干扰细胞增殖。顺铂可以通过血液循环进入内耳，通过扩散或转运蛋白被内耳细胞摄取进入细胞质中，发生水合反应。顺铂上的氯原子被水分子取代后被激活，水合顺铂成为潜在的亲电子体，可以与核DNA和线粒体DNA上两个相邻鸟嘌呤的共价结合，形成加合物，使DNA链内和链间交联，破坏了DNA结构，阻断转录并导致DNA双链断裂，从而阻断细胞周期[4]。

顺铂对内耳器官有3个主要靶点：毛细胞，螺旋神经节和血管纹（耳蜗代谢中枢）[5]。顺铂作用于耳蜗毛细胞，最初损伤外毛细胞（OHCs），随后是内毛细胞（IHCs）。并且随着治疗剂量或持续时间的增加，损伤从耳蜗的基底向顶点扩散[6]，因此顺铂诱导的听力损失通常从高频（4至8kHz）开始，进而影响低频（1至2kHz）下的听觉灵敏度。顺铂作用于螺旋神经节会诱导神经元死亡和螺旋神经节细胞（SGCs）退化，这已经在啮齿类动物耳蜗和螺旋神经节体外培养实验中得到了证实[7]。顺铂也会作用于血管纹细胞，造成线粒体肿胀，表现为周围细胞的空泡化[8]；同时可以观察到血管纹中间细胞萎缩，内耳道电位（endocochlear potential，EP）降低[5]。顺铂在进入血管纹细胞后会长时间滞留其中，这可能是顺铂耳毒性具有进行性的原因之一[9]。顺铂会造成严重的毛细胞缺失、螺旋神经节变性和血管纹状体功能障碍，最终导致感觉神经损伤和听力损失。

顺铂对毛细胞等内耳细胞损伤的方式是诱导细胞凋亡，其最主要诱因是细胞内活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的过量产生和积累。顺铂能够激活内质网-应激途径和线粒体ROS生成途径，产生过量的ROS，消耗线粒体抗氧化酶活性，诱导侧壁螺旋韧带纤维细胞凋亡，破坏线粒体膜通透性，导致钾外流并降低细胞内离子和渗透强度，从而激活正常细胞中的凋亡受体途径，激活促凋亡酶（如半胱天冬酶和促凋亡蛋白酶）引发细胞凋亡[10]。

在整个诱导凋亡的过程中，涉及到很多的信号通路和细胞因子。研究表明，ROS的积累会通过JNK/SAPK信号通路（c-Jun氨基末端激酶，c-Jun N-terminal kinase/应激活化蛋白激酶stress-activated protein kinase），激活信号传导及转录激活因子 1，(Signal transducers and activators of transcription,STAT-1）介导的炎症途径，诱导涉及凋亡的caspase-3和-9活性增强[11]。最新的体外和体内动物实验证明了ATM-Chk2-p53（共济失调毛细血管扩张症突变基因-细胞周期检测点激酶2-p53，ataxia-telangiectasia mutated gene-checkpoint kinase2-p53）信号传导通路也参与了顺铂介导的毛细胞损伤[12]。已经有研究报道选择性GSK-3β（丝氨酸/苏氨酸激酶-3β）抑制剂或者上调细胞自噬能够减轻顺铂诱导的耳毒性，其他研究表明GSK-3β的活性与细胞自噬水平紧密相关[13]。

也有研究发现顺铂相关的耳毒性具有遗传易感性：Tserga等从重复研究中发现了来自5种不同基因的8种不同SNP（包括来自LRP2的rs4668123），显示出与顺铂耳毒性的显着相关性[7]。这些基因主要与抗氧化调节，神经传递或听觉功能有关，从基因层面验证了顺铂的耳毒性机制。

2 耳保护策略

顺铂导致的听力损失与应用顺铂的累积剂量[14]和单次最大使用剂量[15]之间具有显著相关性，且在完成治疗较长时间后，听力损失仍会不断加剧，使得顺铂造成听力损失的发生率与危害程度远高于人们的预期。随着耳毒性的基本机制被确定，预防和修复听力损失的方法也不断被开发和应用。目前对顺铂的耳毒性防护，主要集中在应用抗氧化药物、减少细胞摄取和开发新型铂配合物等。在这几方面的最新进展如下：

2.1 应用抗氧化药物

已有研究表明，顺铂诱导耳毒性的主要原因是氧化应激异常和ROS的过度积累，减少内耳细胞内ROS将保护细胞免受顺铂诱导的细胞凋亡。耳蜗具有内源性机制来处理由顺铂等药物引起的氧化应激。保护性分子包括：谷胱甘肽和抗氧化酶，热休克蛋白，腺苷A1受体（A1AR），转录因子Nrf2和血红素加氧酶-1，以及肾损伤分子（KIM-1）等[16]。尽管这些细胞保护分子在氧化应激后表达上调，但顺铂所施加的氧化应激可以压倒这些固有的防御机制。到目前为止，没有FDA批准的预防顺铂耳毒性的药物，但已经有很多研究尝试使用一些抗氧化物质为耳蜗提供保护以防止细胞凋亡的发生，以缓解顺铂耳毒性。

已知α-硫辛酸（ALA）是最有效的抗氧化剂之一，它参与细胞抗氧化系统，可以用于减轻顺铂诱导的耳毒性。ALA的抗氧化作用已在多种顺铂诱导的损伤模型中广泛证实：在接触顺铂之前用ALA预处理可以显著减少耳蜗细胞中ROS的积累并保护听觉功能[17]。当接受顺铂给药后，ALA对顺铂诱导的耳毒性具有强烈的抑制作用，有效预防了听力损失[18]。其原理是ALA在细胞抗氧化系统中可以作为谷胱甘肽二硫化物的还原剂，代表谷胱甘肽还原酶增加谷胱甘肽水平，有助于谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽的再循环，阻止ROS积累，抑制细胞凋亡[19]。这些研究结果表明，无论在治疗前还是治疗中，采用ALA联合治疗能够持续表现出有效的保护作用，支持了ALA作为顺铂耳毒性治疗用药的可能。

最新报道表明，辣椒素（一种TRPV1激动剂）可有效改善顺铂诱导的听力损失。口服或局部经鼓膜给药，辣椒素可以通过TRPV1的脱敏及CB2受体的激活而具有保护作用，进一步激活JNK/STAT-1信号通路，抑制或消除顺铂诱导的毛细胞损伤及凋亡[20]，从而有效改善听力损失。

咖啡因可以抑制A1AR并拮抗其耳蜗中的内源性保护作用，从而加剧顺铂诱导的听力损失。这一结论在顺铂诱导的小鼠模型中得到了证实[21]。A1AR的细胞保护作用在之前的研究中已经较为明确。这类受体存在于耳蜗中，活化后可以抑制炎症反应，起到细胞保护作用从而抑制顺铂诱导的耳毒性。研究结果还表明，单次给予咖啡因刺激不会增加对OHC的损伤，但会增加耳蜗中的突触异常和炎症反应；而连续给予咖啡因刺激能够加重顺铂诱导的耳毒性并且导致OHC损伤和耳蜗突触异常。咖啡因的这些作用可以通过A1AR拮抗剂来进行调控，如同时服用A1AR的拮抗剂R-RIP能够抵消咖啡因和顺铂对听力损失的影响。这些研究结果强调了咖啡因和顺铂之间可能存在耳毒性中的药物相互作用，并建议应用顺铂治疗的癌症患者应慎用咖啡因。

维生素E是一种缓慢作用的自由基清除剂。一项大鼠模型的前瞻性随机对照试验证明，经维生素E预处理的大鼠接受顺铂后，耳蜗细胞的保存程度更高，证明维生素E可以作为顺铂耳毒性的保护剂[22]。也有研究人员探讨了顺铂联合硫代硫酸钠（STS）作为抗氧化剂降低耳毒性的效果。结果表明，对于109例儿童肝母细胞瘤患者，在顺铂放疗后6h内接受STS治疗可以显著降低患儿的听力损伤风险，且不会影响患儿的生存期[23]。在一项以斑马鱼为模型的研究中，经右美托咪定（DEX）预处理150分钟，然后暴露于顺铂6小时，顺铂导致的细胞凋亡显著低于对照组，表明DEX可有效预防耳毒性[24]。

这些抗氧化药物可以通过影响前文所述的细胞因子和信号通路来调节耳蜗细胞的凋亡过程。如阿司匹林既是一种抗氧化剂，也可以通过抑制NF-κB向细胞核的转运起到额外的而保护作用。周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinases,CDK2）抑制剂可以调节药物诱导的细胞凋亡，从而保护毛细胞。最近，有研究人员在体内和体外实验中证明：GSK-3β的负调控能够显著增强细胞自噬和减弱顺铂诱导的听力损失、OHCs死亡和凋亡，细胞自噬剂3-MA能够逆转GSK-3β负调控的保护作用。

但同时我们也应该注意到，正常情形下细胞内氧化与抗氧化水平处于一种动态平衡状态，一旦失衡，必然引起细胞损害。因此一些学者并不赞成全身应用传统抗氧化剂[25]。有学者提出，尽管氧化应激与很多疾病有重要关联，但不恰当的抗氧化治疗并不能改变疾病发展的进程[26]。甚至有一些meta分析发现包括维生素E和β-胡萝卜素在内的一些抗氧化物质反而会增加癌症的死亡率[27]。

因此，在顺铂治疗的过程中联合应用抗氧化药物，可以有效预防和降低耳毒性，但也要注意合理性，不能过度使用。

2.2 减少细胞摄取

避免顺铂耳毒性的最可靠方法是预防其进入内耳并被摄入到毛细胞胞质中。通过药物，如袢利尿剂，调节血液迷路屏障（BLB）的通透性，以减少顺铂进入内耳[28]。在对细胞摄入的研究中发现，顺铂主要通过毛细胞顶部的转运蛋白，如铜转运蛋白1（CTR1）和有机阳离子转运蛋白2（OCT2），进入细胞质中，调节这些转运蛋白的表达可以抑制顺铂对耳蜗毛细胞的损伤[29]。西咪替丁可以减少CTR1的表达，抑制顺铂的摄取，从而抑制顺铂损伤[30]。但也有研究表明，泮托拉唑（OCT2抑制剂）与顺铂同时输注不能改善顺铂的耳毒性[31]。这是因为在抑制了OCT2的耳蜗细胞中，顺铂摄取由CTR1介导，需要更完全抑制OCT2或其他参与顺铂摄取的转运蛋白才能起到更有效的抑制效果。理想情况下，某些保护性化合物可能是一种非特异性，可逆的阻断剂，如箭毒（D-tubocurarine）[32]，可以与耳毒素一起用于全身或鼓室内注射，减少毛细胞机电转换通道（MET）的渗透性[33]，从而降低对细胞的毒害作用。

2.3 开发新型铂配合物

虽然顺铂作为临床实践中使用的第一种铂类配合物具有良好的广谱抗癌活性，但其肾毒性、神经毒性和耳毒性等副作用限制了其应用。人们越来越注重研发具有同等或更强抗癌作用的多种铂配合物，以有效地消除现有临床药物的缺陷。多种新型铂族配合物有望取代经典的顺铂等抗癌药物，以提高疗效，减少副作用[34]。已经研发出各种顺铂同源物以降低耳毒性（例如卡铂和奥沙利铂）。不幸的是，降低耳毒性往往以降低抗癌效果为代价[35,36]。目前对于铂配合物的研究成果主要有以下几个方面：多核铂配合物对肿瘤细胞的结合能力和杀伤性高于经典的单核顺铂及其类似物；空间位阻铂配合物可防止含巯基的生物分子失活，具有较低的生物毒性；具有各种配体的反式铂配合物有着完全不同的作用机制，有助于研究针对顺铂抗性的新型药物；Pt（IV）配合物在化学性质方面更为稳定，可以口服给药；开发铂类药物传递系统以提高铂类药物的靶向性和选择性。多种方法的组合应用可以开发出具有显著优势的改进成果。随着研究的深入，预计新型铂类配合物在具有强大的疗效同时，可以显著的降低毒性。

迄今，各国科学家已合成并检验了数千种与顺铂相关的金属配合物，研制出以碳铂为代表的第二代铂配合物和以二氯二茂钛为代表的第三代重金属配合物。现在这一领域仍在继续进行大量研究，着重在分子水平上探索金属配合物抗癌活性的机理。

3 结语

自顺铂类药物应用于癌症治疗以来，其耳毒性等副作用也逐渐引起了人们的关注。顺铂通过几种转运蛋白的作用进入耳蜗中的靶细胞并会长期滞留其中。它可以导致DNA损伤，抑制蛋白质合成，积累过量ROS，并激活一系列信号通路和细胞因子，导致细胞炎症和内耳细胞凋亡，引发不可逆的感音神经性听力损失。因此，在应用其治疗癌症的同时，应针对性的采取多种耳保护策略。已有的关于顺铂耳毒性机制研究成果，有助于寻找新型保护性药物或通过其他途径保护内耳听觉系统的结构及功能。还可以从遗传学、流行病学、药物化学等多方面深入研究，以减少顺铂引起的听力损失，改善患者的生活质量，获得巨大的经济效益。