结核分枝杆菌实验室检测技术的对比分析

2021-01-01王彧超

医学食疗与健康 2021年22期

王彧超

【摘要】目的：对比与分析结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）不同实验室检测技术的效果。方法：研究对象为2018年8月至2020年12月在南通瑞慈医院住院诊治的肺结核患者84例，以及同期确诊患其他肺部疾病住院病例且无活动性结核病变征象的患者84例。取所有患者的痰液标本，都给予三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）发光法、涂片、PCR 检测，记录检测时间与判断检测效果。结果：在168例患者中，痰涂片检测与 ATP 发光法检测的时间少于 PCR 检测（P <0.05），痰涂片检测时间少于 ATP 发光法检测（P <0.05）。以痰培養结果为金标准，痰涂片检测、ATP 发光法检测、PCR 检测的敏感性分别为79.76%（67/84）、91.67%（77/84）、98.81%（83/84），特异性分别为88.10%（74/84）、89.29%（75/84）和100.00%（84/84），对比差异有统计学意义（P <0.05）。结论：相对于痰涂片检查、ATP 发光法检测， PCR 技术在结核分枝杆菌实验室检测中耗费时间相对长，但是检测的敏感性与特异性更高，有很好的应用价值。

【关键词】肺结核;结核分枝杆菌;实验室检测技术; PCR 技术;三磷酸腺苷发光法;痰涂片法

【中图分类号】R521 R446.5【文献标识码】A 【文章编号】2096-5249（2021）22-0181-02

当前结核病依然为一种严重的公共卫生问题疾病，如果结核患者能够得到早期的诊断及接受正确的治疗，就可以有效改善患者预后，也可有效预防和控制结核病造成的伤害[1]。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）是引起结核病的重要病原体，其可导致全身各个器官的慢性病理性改变，包括肺内器官与肺外器官等[2]。痰培养法为结核分枝杆菌的诊断金标准，也可在改良罗氏固体培养及在其基础上进行菌种鉴定与药敏时间。但是其耗费时间比较长，也很难区分活菌与死菌，有时候可延误患者获取正确治疗的最佳时机而错失改善预后的机会。痰涂片镜检对于技术人员的要求比较高，有一定的主观性，诊断的特异性有待提高。抗原检测具有操作方便、检测快速等特点，其中三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）发光法是依据活细菌体内均含有一定量的ATP，利用 ATP与荧光素酶的反应，通过荧光强度来间接反映判断ATP 的含量，从而可以判断细菌活力[3-4]。随着检测技术的发展，当前PCR技术得到了广泛应用，特别是 qPCR 技术的荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况[5]。本文对比了上述三种实验室方法检测结核分枝杆菌的效果，希望为临床上合理选择检测技术提供参考。现报道如下。

1对象与方法

1.1研究对象

研究对象为2018年8月到2020年12月在南通瑞慈医院住院诊治的肺结核患者84例，以及同期确诊患其他肺部疾病住院病例且无活动性结核病变征象的患者84例。168例患者中，男性86例，女性82例，年龄（49.27±2.58）岁，体重指数（24.77±1.86）kg/m2，心率（85.20±3.75）次/分，空腹血糖（5.14±0.46）mmol/L。

纳入标准：年龄20～80岁;肺结核患者都明确诊断为活动性肺结核（痰液改良罗氏固体培养基培养阳性）;其他肺部疾病患者X线胸片检查无活动性结核病变（痰液改良罗氏固体培养基培养阴性）;临床资料完整;患者签署了知情同意书;采样检测前所有患者都给未予任何治疗。

排除标准：妊娠与哺乳期妇女;合并非肺部恶性肿瘤者;临床资料缺乏者;合并其他呼吸道传染性疾病者;具有新型冠状病毒肺炎密切接触史的患者。

1.2检测方法

（1）痰涂片检测。取所有患者深喉痰液，取标本中的干酪样、脓样与可逆部分，于干净脱脂玻片涂抹成卵圆形痰膜，然后进行痰涂片镜检，取×300视野，出现≥2条杆菌数量判断为结核分枝杆菌阳性。

（2）ATP发光法检测。取患者的痰液样本，在生物安全柜内进行漩涡振荡混匀，混合ATP虫荧光素酶冻干粉与裂解液，制成ATP酶液。吸入20μL样本中于ATP小试管中，加入100μLATP酶液进行发光值测量，荧光读数比初始读数≥2倍判定为阳性，严格按照操作罗氏公司的操作说明书进行操作。

（3）PCR检测。取患者的痰液标本后，充分匀化使痰液，2000 rpm离心5 min，取下层沉淀提取基因组，采用 qPCR 检测结核分枝杆菌保守序列16sRNA 的表达情况，检测体系为25μL，其中样本基因组量为5μL。正向引物为5‘-CCCTAGACCGGAACTCGGGAATTTT-3’，反向引物为5 ‘-AAGCCTGGACCACAAGACATTAGGGCC-3’， Ct 值≥35判断为阳性， Ct值<40为阴性，检测结果处于两者之间的痰标本需重新检测，重检后若Ct值<40判定为阳性。

1.3观察指标

（1）观察与记录所有患者的检测时间。（2）以痰培养结果为金标准，观察与记录所有患者的检测敏感性与特异性，计算方式为敏感性=真阳例数/（真阳例数+假阴例数）×100%，特异性=真阴例数/（真阴例数+假阳例数）×100%。

1.4统计学方法

采用 SPSS 19.0，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用 t 检验，检验水准为α=0.05。

2结果

2.1检测时间对比

在168例患者中，痰涂片检测与ATP 发光法检测的时间少于 PCR 检测（P<0.05），痰涂片检测时间少于ATP 发光法检测（P<0.05），见表1。

2.2检测效果对比

以痰培养结果为金标准，痰涂片检测、 ATP 发光法检测、 PCR检测的敏感性分别为79.76%（67/84）、91.67%（77/84）、98.81%（83/84），特异性分别为88.10%（74/84）、89.29%（75/84）和100.00%（84/84），对比差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

3讨论

结核分枝杆菌为聚集成分枝状排列繁殖，无菌毛、鞭毛和荚膜，菌体细长略弯曲，抗酸染色阳性，不形成芽孢。结核分枝杆菌为导致肺结核的主要病原体，也可侵犯全身各器官[6]。同时是由于各种因素的影响，当前耐药肺结核患者越来越多，一些患者经过长期正规治疗后结核病灶没有吸收甚至病灶播散、痰菌量没有减少，为此加强早期诊断具有重要价值[7]。痰培养不仅是临床确诊肺结核的金标准，也是判断结核分枝杆菌阳性的重要标准。但是结核分枝杆菌的增殖比较缓慢，在临床检测中常无法及时提供检测报告。痰涂片检查具有操作简便、快速等特点，但是其检出阳性率低，不能鉴定细菌的活力，容易造成误诊与漏诊。ATP发光法是采用免疫层析原理进行测定，可为活动性肺结核的诊断提供直接的证据，也具有操作方便、快速有效等优势。有研究显示，荧光检测的强度与被测样品中结核分枝杆菌增殖产生的ATP 含量成正比，为此可判断结核分枝杆菌的生长情况[8]。本研究显示，在168例患者中，痰涂片检测与ATP 发光法检测的时间少于 PCR 检测（P<0.05），痰涂片检测时间少于ATP 发光法检测（P<0.05），但是都少于1d。从机制上分析， qPCR 方法采用的荧光探针序列是针对结核分枝杆菌菌群特异性核酸序列而设计，采用了荧光标记的探针实时监测扩增过程中的荧光信号，能够有效的控制污染问题及有效减少假阴性结果。

肺结核的临床诊断是建立在临床症状、影像学检查、实验室检测、病理检测等多方面综合诊断的基础之上，痰培养检测为金标准，但是检测的时间比较长。ATP发光法是当前比较常见微生物检测技术之一，也能判断结核分枝杆菌的耐药情况，有利于临床用药的及时调整。不过自然界中所有微生物体内均含有一定量的ATP，ATP与荧光素酶混合后能产生荧光，会产生一定的漏诊情况。本研究采用的PCR检测融入了荧光标记的检测探针，实现了扩增过程的实时监测，可使RNA扩增产物的检测与扩增过程同步化，简化了操作过程，有利于提高诊断的效果与质量[9-11]。本研究显示，以痰培养结果为金标准，痰涂片检测、 ATP 发光法检测、PCR检测的敏感性分别为79.76%、91.67%、98.81%，特异性分别为88.10%、89.29%和100.00%，对比差异有统计学意义（P<0.05），表明 PCR检测具有更高的检测敏感性与特异性。本研究也存在一定的不足，没有纳入正常健康人群，涉及对比的检测方法也比较少，将在后续研究中進行探讨。

综上所述，相对于痰涂片检查、 ATP发光法检测， PCR 技术在结核分枝杆菌实验室检测中耗费时间相对长，但是检测的敏感性与特异性更高，有很好的应用价值。

参考文献

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