miR-150下调Notch3抑制人脂肪干细胞成骨分化*

王 俏 柏树令 李志远 王小红 田晓红 常世杰 佟 浩 范 军△

（中国医科大学公共基础学院，1 组织工程教研室，2 生物医学工程教研室，沈阳 110001）

脂肪干细胞是一类多能干细胞，具有多向分化潜能，在骨损伤修复过程中发挥重要作用[1-5]。微小核糖核酸（microRNAs， miRNAs）是一类22 ～24 bp 的非编码RNA，在脂肪干细胞的谱系定型、成脂和成骨发育过程发挥重要作用[6-7]。研究表明，破骨细胞分化过程中miR-150 的表达量呈现下降趋势[8]。体内研究表明，miR-150 可作为成骨负向调控因子，通过影响Runt 相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX-2）的表达调控成骨分化[9]。然而miR-150 影响人脂肪干细胞（human adipose-derived stem cells， hADSCs）成骨分化的机制尚不清楚。研究表明，Notch3 参与成骨分化过程[10]，课题组前期研究发现miR-150过表达后Notch3 的表达量下降。本研究通过上调miR-150 在hADSCs 中的表达，探索miR-150 通过调控Notch3 对hADSCs 成骨的影响，为临床骨缺损的修复和治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

胎牛血清、DMEM/F12 培养基、 青霉素/链霉素溶液、胰蛋白酶（美国Gibco 公司）；Lipofectamine 2000（美 国Invitrogen 公 司 ）、pmirGLO 质粒（武汉基因创造生物工程有限公司）；siPORTTMNeoFXTM染剂（美国Applied Biosystems公司）；SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、BCA 蛋白测定试剂盒（上海碧云天有限公司）；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ （Tli RNaseH Plus）试剂盒（日本TaKaRa）；茜素红染 液、TRIzol 试剂（美国Invitrogen 公司）、异丙醇、抗坏血酸、地塞米松、 β-甘油磷酸钠（北京索莱宝科技有限公司）；碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒（美国 Sigma 公司）。

1.2 hADSCs 的分离和培养

参照本实验室前期工作[11]，从人脂肪组织中分离培养hADSCs，将细胞培养在DMEM/F12 完全培养基中（10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素），置于37 °C、5%的CO2培养箱中。每2 ～3 d 更换 1 次细胞培养基。待细胞密度达到80% ～90%时应用胰蛋白酶进行消化传代。

1.3 hADSCs 成骨分化过程中miR-150 的表达

将hADSCs计数后接种于60 mm培养皿中，待细胞密度达80%～90%时加入配制好的成骨细胞诱导液（即F12+10%胎牛血清+10 mmol/L β-甘油磷酸钠+0.1 μmol/L地塞米松+50 mg/L维生素C）。将hADSCs分别诱导0、1、3、7、11、14 d。采用Real-time PCR检测miR-150的表达。

1.4 hADSCs 的感染与转染

将hADSCs 计数后，以1×104/孔的密度接种于6 孔板中，待细胞密度达80%～90%时，将携带miR-150 的腺病毒（美国维真生物）感染hADSCs 构建miR-150 过表达组（miR-150 组）；用空载体病毒转染构建绿色荧光蛋白对照组（GFP组）；不作任何处理的设为空白对照组（NC 组），4 h 后换液。继续培养48 h 后更换培养基，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。使用针对干扰Notch3（shNotch3-siR）的慢病毒和干扰对照（shNC）的包装有发夹（sh）RNA 的 Notch3 表达载体（Plent-U6-GFP-Puro，8.3 kb）的慢病毒感染hADSCs，构建Notch3 敲低的hADSCs 组（Notch3-siR 组）、GFP 对照组（GFP 组）和空白对照组（NC组），4 h 后换液。继续培养48 h 后更换培养基，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。shRNA靶序列如下： 5′-GCACCCAGTCCGCCCTGAGCA AATTCAAGAGATTTGCTCAGGGCGGACTGGGT GCTTTTT-3′（shNC），5′-GATCCGCTAGCTTCT CGTGTGCTTGTTTCAAGAGAACAAGCACACG AGAAGCTAGCTTTTTTA-3′（Notch3-siR）。

1.5 Real-time PCR 检测miR-150-5p 的表达

MiR-150 引物（锐博生物，货号：MQP-O102），每（5 ～10）×106个细胞加1 mL TRIzol 后，反复用枪吹打以裂解细胞后转入 1.5 mL EP 管中；以每1 mL TRIzol 液加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡后离心。取上层水相再加入等体积异丙醇，放置10 min 后，再离心10 min。弃去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀。弃上清再把沉淀干燥得到的RNA 加无酶水溶解。分别用400 ng RNA反转录成cDNA。再把得到的cDNA 用Tli RNaseH Plus 试剂盒进行扩增。

1.6 荧光素酶报告实验分析 miR-150 的下游靶基因

运用TargetScan 软件预测分析，Notch3 可能是miR-150 的下游靶基因。用点突变试剂盒（Agilent Technologies 公司）使Notch3 3′端的miR-150 的结合序列突变，然后把突变的Notch3（Mut-Notch3）和野生型Notch3（WT-Notch3）分别插入到pmirGLO质粒（武汉基因创造生物工程有限公司）的SacI和XhoI切割位点之间。采用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将含有Mut-Notch3或WT-Notch3萤光素酶报道分子和miR-150模拟物或阴性对照（Control）联合转染至hADSCs。48 h后，按试剂盒说明书操作检测细胞萤火虫和海肾荧光素酶活性，将海肾荧光素酶活性标准化为萤火虫荧光素酶 活性。

1.7 hADSCs 的成骨诱导

NC组、GFP组、miR-150组细胞于6孔板中培养48 h 后，去除培养液和悬浮细胞。加入成骨细胞诱导液连续诱导7 d 后进行ALP 染色及ALP 活性检测。将NC 组、GFP 组、Notch3-siR 组 于6 孔 板中培养48 h 后，去除培养液和悬浮细胞。加入成骨细胞诱导液连续诱导7 d 后，采用免疫印迹检测RUNX-2 表达。

1.8 免疫印迹检测Notch3 和RUNX-2 蛋白的表达

用蛋白裂解液收集各组细胞的蛋白质， BCA法检测各组蛋白质浓度，等质量蛋白上样，SDSPAGE 电泳后用湿转法将蛋白质转到PVDF 膜上，再用5%的奶粉溶液室温封闭2 h。加入Notch3 鼠来源抗体（sc-515617， 1∶200， Santa Cruz， 美国）、RUNX-2 兔来源抗体（AB41419，1∶1 000， AbSci， 美国）、GAPDH 鼠来源单克隆抗体（60004，1∶5 000， Proteintech，美国），4°C 孵育过夜。次日用TBST 洗膜后加入HRP 标记的山羊抗鼠、山羊抗兔的二抗（1∶5 000，AbSci， 美国）室温孵育 2 h。TBST 洗膜3 次，凝胶成像系统采集图像。用Image J 对图像进行灰度值统计分析。

1.9 统计学处理

采用SPSS18.0 软件对数据进行分析，2 组资料均值之间用独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hADSCs 成骨诱导过程中miR-150 的表达变化

Real-time PCR 结果显示 hADSCs 成骨诱导1、3、7、11、14 d 后， miR-150 的表达量随着诱导时间的延长出现下降（图1）。

2.2 过表达miR-150 可抑制hADSCs 的成骨分化

荧光倒置显微镜下观察到GFP 组和miR-150组中有大量绿色荧光蛋白表达，而对照组未见表达（图2）。Real-time PCR 结果显示，miR-150 组miR-150 表达量明显高于GFP 组和NC 组（图3），表明包装miR-150 的腺病毒成功感染hADSCs。成骨诱导7 d 后，免疫印迹检测结果显示，miR-150组RUNX-2蛋白表达量明显低于NC组和GFP 组（图4）；ALP 活性检测结果显示，miR-150 组ALP活性低于NC 组和GFP 组（图5）；ALP 染色结果显示，与NC 组 和GFP 组比较，miR-150 组ALP染色强度减弱（图6）。

2.3 miR-150 靶向调控Notch3

为明确miR-150 对Notch3 的直接靶向调控，采用荧光素酶报告分析证明预测的相互作用。结果显示，miR-150 过表达通过与Notch3 的3′UTR相互作用显著抑制荧光素酶的活性，而miR-150 对Mut-Notch3 组的荧光素酶无影响（图7）。免疫印迹结果显示，miR-150 组Notch3 蛋白的表达量明显低于NC 组和GFP 组（图8）。

2.4 Notch3 的下调减弱了hADSCs 的成骨分化

荧光倒置显微镜下观察到GFP组和Notch3-siR组中有大量绿色荧光蛋白表达，而NC组未见表达，表明成功转染Notch3-siR至hADSCs（图9）。免疫印迹检测结果显示，Notch3-siR组Notch3蛋白的表达量明显低于NC组和GFP组（图10）。成骨诱导 7 d后，Notch3-siR组RUNX-2的表达显著低于NC组和GFP组（图11）。

3 讨论

外伤、骨折或肿瘤切除可导致骨丢失、骨缺损。骨移植手术是治疗大骨缺损的主要治疗手段，但手术存在诸如供体组织不足和潜在的免疫原性等不足[12]。近年来，组织工程学提供了一种新的策略，可以体外培养出生物活性组织，用于骨缺损的修复治疗。一些临床研究已经证实了干细胞具有分化为成骨细胞的潜力，可促进骨缺损的愈合[13-15]。hADSCs 具有来源相对丰富，易于分离的特性，因此被广泛用作骨再生研究。另一方面，培养细胞的高增殖和向间充质谱系分化的潜力是选择hADSCs的原因[4，16]。

miRNA 是一种内源性非编码单链小RNA 分子，可通过与3′非翻译区（3′-UTR）或核苷酸不完全互补来调控靶基因开放阅读框，最终通过抑制翻译或促进mRNA 衰减来抑制基因表达[17]。miRNA参与多种生理和病理过程，在干细胞的成脂、成骨和增殖过程中发挥重要作用[18-19]。Notch 信号是由配体（Jagged-1，-2 和Delta-like-1、-3、-4）与细胞表面Notch 受体（Notch-1、-2、-3、-4）在早老素-γ-分泌酶复合物上最终裂解受体，并释放Notch细胞内结构域（NICD），后者移入细胞核并激活细胞的转录[20]。Notch 通路参与人骨髓间充质干细胞成骨分化过程[21]。miRNA 可通过Notch 通路调控细胞增殖、分化，例如miR-34a 调控Notch 信号通路促进了根尖乳头干细胞成骨分化[22]。本研究通过TargetScan 软件预测分析，Notch3 可能是miR-150 的靶基因，双荧光素酶报告实验也证实了miR-150 可靶向调控Notch3。进一步研究结果显示，hADSCs 过表达miR-150 后，显著抑制Notch3 的表达水平。但miR-150 和Notch3 是否参与hADSCs的成骨分化尚不清楚。本研究证实miR-150 过表达抑制了hADSCs 成骨分化，Notch3 敲除后同样抑制hADSCs 的成骨分化。郭伟壮等[8]研究也显示，miR-150 通过负性调控RUNX-2 的表达影响骨髓间充质干细胞成骨分化。

综上，本研究证实了miR-150 对hADSCs 成骨分化具有抑制作用，其机制可能是miR-150 下调Notch3 的表达，进而抑制成骨分化，为后期临床骨组织缺损的修复和治疗提供了新的实验依据，但具体作用机制还需进一步研究。

图1 miR-150 在hADSCs 成骨诱导分化的表达， *P＜0.05、**P＜0.01 vs 0 d.图2 过表达miR-150 的hADSCs 的构建，标尺=100 μm。A：NC 组；B：GFP 组；C： miR-150 组.图3 miR-150 在hADSCs 中的表达。 *P＜0.05 vs GFP 组.图4 hADSCs 成骨诱导7 d RUNX-2 表达。A： RUNX-2 在hADSCs 中的表达情况，免疫印迹；B： RUNX-2 半定量分析，*P＜0.05 vs GFP 组.图5 hADSCs 成骨诱导7 d ALP 活性，**P＜0.01 vs GFP 组.图6 hADSCs 成骨诱导7 d ALP 染色，标尺=50 μm。A： NC 组；B： GFP 组；C： miR-150 组.图7 荧光素报告实验结果，**P＜0.01 vs NC 组.图8 Notch3 在hADSCs 中的表达。Notch3 在hADSCs 中的电泳图及Notch3 半定量分析， **P＜0.01 vs GFP 组.图9 Notch3-siR 感染hADSCs， 标尺=100 μm。A：NC 组；B： GFP 组；C： Notch3-siR 组.图10 Notch3 在hADSCs 中的表达。Notch3 在hADSCs 中的电泳图及Notch3 半定量分析，*P＜0.05 vs GFP 组.图11 RUNX-2 在hADSCs 的表达。RUNX-2 在hADSCs 的电泳图及 RUNX-2 半定量分析， *P＜0.05 vs GFP 组.Fig 1 Expression of miR-150 in hADSC osteogenic differentiation on 0 d， 1 d， 3 d， 7 d， 11 d and 14 d. *P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 d.Fig 2 Construction of hADSCs overexpressing miR-150， bar=100 μm. A：NC group； B： GFP group； C： miR-150 group.Fig 3 miR-150 expression in hADSCs. *P＜0.05 vs GFP group.Fig 4 RUNX-2 expression of hADSCs at 7 d after osteogenesis induction. A： RUNX-2 expression in hADSCs； B：Semi-quantitative analysis of RUNX-2， *P＜0.05 vs GFP group.Fig 5 ALP activity at 7 d after hADSCs osteogenic induction. **P＜0.01 vs GFP group.Fig.6 ALP staining at 7 d after hADSCs osteogenic induction， bar=50 μm. A： NC group； B： GFP group； C：miR-150 group.Fig 7 Fluorescein reported experimental results， **P＜0.01 vs NC group.Fig 8 Notch3 expression in hADSCs. The electrophoretogram of Notch3 expression in hADSCs and semi-quantitative analysis of Notch3，**P＜0.01 vs GFP group.Fig 9 Knockout of Notch3 protein in hADSCs， bar=100 μm. A：NC group； B： GFP group； C：Notch3-siR group.Fig 10 Notch3 expression in hADSCs. The electrophoretogram of Notch3 expression in hADSCs and semi-quantitative analysis of Notch3， *P＜0.05 vs GFP group.Fig 11 Expression of RUNX-2 in hADSCs. The electrophoretogram of expression of RUNX-2 and semi-quantitative analysis of RUNX-2， *P＜0.05 vs GFP group.