毛竹屑多糖分离纯化及抗炎活性研究
2020-12-31许子竞杨玉琼
许子竞，杨玉琼，刘 茜
(1.贵州工程应用技术学院天然产物协同创新中心，中国 毕节 551700；2.毕节市民族药用植物研究重点实验室，中国 毕节 551700；3.梧州学院化学工程与资源再利用学院，中国 梧州 543000)
毛竹(Phyllostachysheterocycla(Carr.)Mitfordcv.Pubescens)，又叫楠竹，体形笔直修长,是我国长江以南栽种的主要经济林之一。随着工业化的发展，毛竹常被制作成各种竹板材，各地生产企业用量大；然而在竹材加工过程中，产生了大量的锯屑和碎片，大多被当做废弃物而污染环境。随着现代天然产物化工技术的发展，毛竹被发现全身是宝。竹叶中含有黄酮类、酚酸、内酯、生物碱、生物活性多糖、氨基酸肽类、蒽醌类、萜类内酯等[1-3]，大都有较强的生物活性作用[4-6]。目前，对竹叶的成分和开发应用研究得较多，竹叶中一些黄酮类提取物在食品、药品和化妆品中已得到了一定的应用[7，8]；但对废弃的竹屑化学成分研究较少，尤其是竹屑中含有的具有生物活性的多糖[9，10]，鲜见研究和报道。本试验利用微波水提竹屑中的多糖，然后进行分离、纯化、纯度检测及分子质量测定[11，12]，并将精制的竹屑多糖(Polysachaide ofPhyllostachyspubescenschip, PPCP)对致炎小白鼠进行抗炎症试验[13-15]，为竹屑多糖在食品、保健、日化等行业的应用提供理论依据，以期进一步开发竹类资源。
1 材料与方法
1.1 材料试剂与仪器
竹屑由贵州赤水赤化集团提供。
乙酸乙酯、无水乙醇、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、氯仿、正丁醇、氯化钠、磷酸、磷酸氢钠，均为分析纯；D101 大孔树脂 (河北翔蓝化工公司)；透析袋(上海华美生物工程公司)；DEAE-纤维素(上海化学试剂一厂)；Sephadex G-15，Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia公司)；巴豆油合剂、昆明系小鼠(均购自贵州医科大学)，葡聚糖标样(美国Sigma公司)；吲哚美辛(Sigma-Aldrich)。
中速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);2102PCS 紫外-可见分光光度计(尤尼科(上海)仪器有限公司);冷冻真空干燥器(北京博医康技术有限公司);旋转蒸发仪系列(河南益华设备有限公司);微波提取设备(10 L)(天水华源微波设备有限公司);BSZ-100B 型自动部分收集器(上海青浦泸西仪器公司);Waters 515型凝胶色谱仪(美国Waters 公司)。
1.2 试验方法
1.2.1 竹屑多糖PPCP的提取、分离、纯化[16，17]
1.2.1.1 提取 取烘干恒重的竹屑粉末6 kg，用微波提取器分2批次，在80 ℃下提取3次，每次40 min；提取液离心去杂、减压浓缩至原体积的1/10左右，加乙醇至含醇80%～85%，静置过夜，离心，得PPCP沉淀物。PPCP冷冻干燥，得粗多糖干燥物，用索氏提取器，以乙酸乙酯回流提取PPCP干燥物，去除非糖脂溶性物质。
1.2.1.2 脱色 将1.2.1.1所得PPCP配成水溶液，直至沉淀物不再溶解，过滤，取滤液过D101大孔树脂，用纯化水洗脱，收集水洗脱液，浓缩至稀流膏状。
1.2.1.3 分离 将1.2.1.2稀流膏稀释，DEAE-纤维素柱梯度洗脱，依次用纯化水和NaCl溶液(0.16，0.26，0.36 mol·L-1)洗脱，用苯酚-硫酸显色检测，紫外检测吸光度，收集水和NaCl溶液洗脱液，依次命名PPCP-0，PPCP-0.16，PPCP-0.26和PPCP-0.36。
1.2.1.4 脱蛋白 用水、NaCl溶液洗脱液，采用Sevage(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)法脱蛋白，在紫外260～280 nm处检测，无明显吸收峰，表明脱蛋白已符合试验要求。
1.2.1.5 脱盐 脱蛋白后的PPCP溶液过葡聚糖凝胶Sephadex G-15柱，脱盐。
1.2.1.6 透析 将1.2.1.5的PPCP溶液浓缩，装入精密透析袋(1.0 kDa)内，活水透析3日以上，去除残留盐及色素。
1.2.1.7 凝胶纯化 由于PPCP-0，PPCP-0.26和PPCP-0.36质量过少，不足以支撑后续研究。将透析后质量较多的PPCP-0.16溶液浓缩，过0.45 μm微孔滤膜，经琼脂糖凝胶Sepharose 6 FF柱纯化水洗脱，自动收集器收集，收集管用苯酚-硫酸显色检测，依据吸光度强弱绘制洗脱曲线，根据曲线峰形收集合并试管收集液，得3个组分PPCP-0.16-1，PPCP-0.26-2和PPCP-0.36-3，冷冻干燥。
1.2.2 PPCP组分纯度鉴定和相对分子质量测定 采用凝胶渗透色谱法，Waters 600型凝胶色谱仪，TOSOH BIOSEP G4000SWXL柱(7.8 mm×300 mm )，柱温：40 ℃,检测器温度：40 ℃；流动相：0.05 mol·L-1H3PO4-Na2HPO4缓冲液(pH6.7，加质量分数为0.05%的NaN3)；流速:1.0 mL·min-1；示差折光检测，进样体积20 μL；以平均分子量(Mp)为2.14×103，4.35×103，1.248×104，2.96×105，4.77×104，8.010×104，1.12×105和2.25×105的葡聚糖为对照品检测。
1.3 精制多糖PPCP消炎活性研究
将精制多糖(脱蛋白后的多糖)，对昆明种小鼠做抗炎活性试验。小鼠50只，体重19～21 g，雌雄各半，按体重随机分为模型组(纯化水10 mL·kg-1)，阳性对照(吲哚美辛 5 mg·kg-1)组，按低(0.1 mg·kg-1)、中(0.5 mg·kg-1)、高(1.0 mg·kg-1)剂量药给小鼠灌胃，连续3 d给药，最后一次给药后30 min于各鼠左耳用2%巴豆油合剂0.05 mL致炎，右耳作对照[18，19]，4 h后将小鼠拉断颈椎处死，剪下两耳，用直径8 mm打孔器分别在同一部位打圆耳片，分析天平称取小鼠左右耳质量，以其差值作为炎性肿胀程度，并计算肿胀抑制率,计算公式为：肿胀率=(右耳质量-左耳质量)/左耳质量；抑制率=(1-给药组平均肿胀率/模型组平均肿胀率)×100%。
2 结果与分析
2.1 竹屑多糖微波辅助提取及脱蛋白
6.0 kg竹屑在微波辅助下水提，得粗多糖PPCP 144.03 g,苯酚-硫酸检测，粗多糖提取率为 2.04%，粗多糖PPCP经脱色、脱蛋白，得精制PPCP 62.29 g。PPCP脱蛋白前后经紫外线检测，在250～280 nm处无吸收峰，如图1所示，表明PPCP脱蛋白很好。
2.2 PPCP上DEAE-纤维素柱梯度洗脱
PPCP溶液上DEAE-纤维素柱洗脱分离，分别用纯化水，NaCl溶液(0.16，0.26，0.36 mol·L-1)梯度洗脱，苯酚-硫酸显色，依据紫外线吸收强度，绘制洗脱曲线。图2为0.16 mol·L-1NaCl溶液洗脱PPCP的吸光度曲线图，其中1 BV=10 mL。
图1 紫外检测PPCP脱蛋白前后图谱Fig. 1 UV spectra of PPCP before and after removing protein
图2 0.16 mol·L-1 NaCl溶液在DEAE—纤维素柱上洗脱曲线Fig. 2 Elution curve of 0.16 mol·L-1 NaCl solution on DEAE-cellulose column
2.3 PPCP-0.16上琼脂糖凝胶Sepharose 6 FF柱纯化
将0.16 mol·L-1NaCl溶液洗脱DEAE-纤维素柱的收集液，用Sepharose 6 FF柱进一步分离纯化，纯化水洗脱，依据紫外吸光度强弱与对应收集的试管数(每支试管容量10 mL，计1 BV)，绘制吸光度与试管数的洗脱曲线，如图3所示，依据曲线形状从左至右依序分别命名为PPCP-0.16-1，PPCP-0.16-2和PPCP-0.16-3。
2.4 PPCP组分纯度鉴定和相对分子质量测定
采用高效凝胶过滤色谱法进行鉴定分析，同时测定PPCP-0.16-1，PPCP-0.16-2和PPCP-0.16-3相对分子质量，由图4可知，3个组分经高效凝胶过滤色谱检测，得相对对称的单一洗脱峰型，表明竹屑粗多糖PPCP经树脂脱色、脱蛋白、DEAE-纤维素柱分离、Sephadex G-15和透析脱盐、Sepharose 6 FF进一步纯化，得相对均一的多糖组分，其相对分子质量及分布参数如表1所示。
图3 0.16 mol·L-1NaCl洗脱液上Sepharose 6 FF柱分离组分曲线Fig. 3 Separation curve of 0.16 mol·L-1 NaCl eluent on Sepharose 6 FF column
表1 PPCP-0.16 纯化3个组分的相对分子质量和分布参数
图4 PPCP-0.16-1，PPCP-0.16-2和PPCP-0.16-3 分子过凝胶的色谱检测图Fig. 4 Chart of PPCP-0.16-1，PPCP-0.16-2 and PPCP-0.16-3 through the chromatographic detection gel
2.5 精制多糖PPCP的抗消炎活性试验
精制多糖PPCP高、中剂量及阳性对照药(吲哚美辛)能降低巴豆油致小鼠耳廓肿胀，且与模型对照组相比有显著性差异(P<0.05),见表2.
表2 PPCP对小鼠耳片肿胀的影响
3 结论
竹屑在微波辅助下水提获得粗多糖PPCP,粗多糖提取率为 2.04%，再经树脂D101脱色和Sevage法脱蛋白，得精制PPCP。用0.16 mol·L-1NaCl溶液洗脱DEAE-纤维素柱，洗脱液经Sephadex G-15和透析脱盐，再经Sepharose 6 FF进一步纯化，得3个相对均一的多糖组分PPCP-0.16-1，PPCP-0.16-2和PPCP-0.16-3，其峰值分子量分别为5 782，5 845，4 731。精制多糖PPCP对致炎小白鼠进行抗炎试验，结果表明，精制PPCP对炎症有一定的抑制率。目前，国内外对竹屑多糖的研究鲜有报道，本研究将为竹屑的开发利用提供理论依据。
