棉花籽水提物对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响

李 瑶，吴秋雪，张 宇，张文天，王文宇，宋国威，张伟伟,2

(1.齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院，中国 齐齐哈尔 161000； 2.抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室，中国 齐齐哈尔 161000)

高等脊椎动物出生后肌肉的生长主要依赖骨骼肌卫星细胞的增殖分化导致的肌纤维长度的增加和周径的增大。因此，肌纤维的数量对肉的产量和品质有重要影响，研究肌肉的增殖分化情况对于改良肉的品质具有重要的指导意义。目前，关于全棉籽和棉粕的研究主要集中在代替蛋白质饲料上，关于全棉籽中有效成分及作用机制的研究较少，本试验研究棉花籽水提物对骨骼肌卫星细胞增殖的影响，可为棉花籽的开发利用奠定基础。

骨骼肌作为动物机体的重要组成部分，它的生长发育是生物学研究的重要内容[1]。研究表明多种因素可调控骨骼肌卫星细胞的生长发育。Chen等人发现骨骼肌主要由有丝分裂后的多核肌纤维组成。肌生成是多步骤过程，包括骨骼肌卫星细胞的激活、增殖、分化和多核肌纤维的形成[2]。王男等人发现当骨骼肌生长和再生需要时，干细胞(骨骼肌卫星细胞)就会被激活，然后开始增殖和分化形成肌纤维，从而形成肌肉组织[3]。

棉花籽是棉花(属于被子植物锦葵目、锦葵科、棉族、棉属)作物的籽实，具有高能、高蛋白、高纤维的特殊营养特点，是一种既能补充蛋白、能量，又能提供纤维的高营养饲料[4]。佟建明等人用添加高含量棉籽粕的日粮饲喂肉仔鸡，结果显示棉籽粕日粮组和大豆粕日粮组的肉鸡成活率差异不显著，表明棉籽粕可作为肉鸡饲料中主要的蛋白质来源[5]；周联高等人用3%和6%棉籽粕代替豆粕饲喂樱桃谷鸭，对其屠宰性能没有显著影响[6]；吐尔逊帕夏等人的试验结果表明，用50%和100%的棉籽壳替代芦苇，11月龄羔羊胴体质量和净肉量显著提高[7]。这些研究结果说明棉花籽可以作为食用蛋白质饲料喂食动物，可使动物质量和肉量提高，进而说明棉花籽的有效成分可能存在促进细胞增殖分化的作用。本文选择牛骨骼肌卫星细胞为研究对象，考察棉花籽水提物对其增殖的影响，旨在为棉花籽的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所需棉花籽产品购于亳州市知乐园农产品销售有限责任公司；棉酚标准品购于信阳市中检计量生物科技有限公司(中检计量)；CCK-8试剂盒购于上海优宁维科技股份有限公司；蛋白提取试剂盒购自碧云天生物公司；CCNB1，CCND1和β-actin一抗购自Abcam公司；羊抗兔二抗IRDye800CW购自美国LI-COR公司。

1.2 试验方法

1.2.1 棉花籽水提物制备 分别称取4份1 g粉碎后的棉花籽，加入20 mL水，分别浸泡10，15，20，25 h后，煮沸于水浴锅中，煮沸时间为4 h(期间根据情况加水)，经过滤装置收集上清液，溶液终体积定容为20 mL，然后配置成质量浓度为20，40，80及160 mg·L-1的棉花籽水提物，最后4 ℃冰箱内保存。

1.2.2 HPLC-MS检测棉花籽水提取物中棉酚含量 利用高效液相色谱法检测上述制备的棉花籽水提物是否含有棉酚。条件为：色谱柱 Intertsil ODS-2(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.2%磷酸(体积比为 85∶15)溶液，流速 1.0 mL·min-1，紫外检测波长 235 nm，进样量 20 μL，柱温 25 ℃。

1.2.3 牛骨骼肌卫星细胞的制备及分化 牛骨骼肌卫星细胞(MDSCs)由本实验室制备并鉴定[8]。在生长培养基(高糖DMEM+20%胎牛血清+10%马血清+5%青/链霉素) ，37 ℃，5%CO2的培养箱中培养牛MDSCs细胞，当细胞汇合度达到80%时，消化细胞以105个·孔-1接种于6孔细胞培养板中，加入生长培养基进行培养，当细胞汇合达85%后，更换为2%分化培养基(DMEM高糖培养液+2%马血清)，在分化时间分别为0 h (MDSC-P)，3 d(MDSC-D1)和5 d (MDSC-D2)时观察细胞形态变化并拍照。

1.2.4 CCK-8法检测细胞活力 将对数生长期的牛骨骼肌卫星细胞接种到96孔板中，培养24 h后，分别加入终质量浓度为0，20，40，80，160 mg·L-1的不同浸泡时间的棉花籽水提物，每个浓度3个孔，培养箱中继续培养48 h，加入10 μL CCK-8检验试剂作用细胞2 h，酶标仪450 nm波长处测定其光吸收值，检测细胞活力。实验重复3次。

1.2.5 显微镜下观察细胞形态 将对数生长期的牛骨骼肌卫星细胞接种到6孔板中，培养24 h后，分别加入终质量浓度为0和20 mg·L-1的不同浸泡时间的棉花籽水提物，培养箱中继续培养48 h，显微镜下观察细胞形态并拍照。

1.2.6 Western Blot检测牛骨骼肌细胞增殖相关基因表达 将对数生长期的牛骨骼肌卫星细胞接种到6孔板中，培养24 h后，分别加入终质量浓度为0和20 mg·L-1的不同浸泡时间的棉花籽水提物，培养箱中继续培养48 h，提取蛋白质，进行SDS-PAGE电泳。利用Bio-Rad电转印仪将蛋白质湿转到0.45 μm PVDF膜上，使用Odyssey封闭液室温封闭2 h，一抗CCNB1(ab191441, abcam)，CCND1 (ab103924, abcam)，β-actin (ab22555, abcam)按照1∶500稀释，4 ℃孵育过夜，次日PBST洗膜，二抗室温孵育1 h，在Odyssey红外荧光扫描成像系统中进行扫描检测。

1.3 统计分析

数据通过SPSS 16.0统计软件分化处理后，以平均数±标准误差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。利用GraphPad Prism 5软件作图。

2 结果与分析

2.1 棉花籽水提取的HPLC-MS分析

根据液相色谱图(图1)可知，分别浸泡10，15，20，25 h的棉花籽水提物检测不到棉花籽中的游离棉酚，说明棉花籽水提物在煮沸之后可以去除游离棉酚。

(a)和(b)分别为50，100 mg·L-1的棉酚标准品；(c),(d),(e)及(f)分别为浸泡10，15，20，25 h的棉花籽水提物。图1 棉花籽水提物中棉酚检测结果Fig. 1 Detection results of gossypol in cotton seed water extract

2.2 牛骨骼肌卫星细胞的分化

培养的MDSCs在生长培养基中未见肌管出现(图2，MDSC-P)，在2%分化培养基作用下诱导分化3 d和5 d，细胞之间相互融合形成肌管，肌管呈光滑长条形，肌管之间多呈平行排列(图2，MDSC-D1)。随着诱导分化时间的延长，数量众多的肌管自发融合为更粗的肌管(图2，MDSC-D2)，说明所用细胞符合实验的要求，能进行下一步实验。

图2 MDSCs 分化后细胞形态(10×10)Fig. 2 Morphology characterization of MDSCs(10×10)

2.3 棉花籽水提取对牛骨骼肌卫星细胞活力的影响

浸泡10，15，20，25 h的棉花籽水提物对牛骨骼肌卫星细胞活力的影响见图3。由图可知，与对照组相比，浸泡10 h和15 h的棉花籽水提物在20 mg·L-1时可提高细胞活力(P<0.05)，之后随着棉花籽水提物浓度的增大细胞活力呈下降趋势。浸泡20 h和25 h的棉花籽水提物均可提高细胞活力，其中20 mg·L-1时效果最显著(P<0.05)。

图3 棉花籽水提取对牛骨骼肌卫星细胞活力的影响 Fig. 3 Effect of cotton seed water extraction on the viability of bovine skeletal muscle satellite cells

2.4 棉花籽水提取对牛骨骼肌卫星细胞的影响

浸泡10，15，20，25 h的棉花籽水提物对牛骨骼肌卫星细胞的影响见图4，由图可知，与对照组相比，20 mg·L-1的棉花籽水提物可增加牛骨骼肌卫星细胞的数量，细胞形态未见明显的变化。

图4 棉花籽水提取对牛骨骼肌卫星细胞的影响(10×10)Fig. 4 Effect of cotton seed water extraction on bovine skeletal muscle satellite cells(10×10)

2.5 棉花籽水提取对牛骨骼肌卫星细胞周期相关蛋白表达的影响

浸泡不同时间的20 mg·L-1棉花籽水提物对牛骨骼肌卫星细胞周期相关蛋白表达的影响见图5，由图可知，与对照组相比，20 mg·L-1的棉花籽水提物可促进牛骨骼肌卫星细胞周期相关CCND1和CCNB1蛋白的表达，其中浸泡20 h的棉花籽水提物效果最明显，可使CCND1蛋白表达提高1.31倍(P<0.05)，CCNB1蛋白表达升高1.47倍(P<0.05)。

图5 棉花籽水提取对牛骨骼肌卫星细胞周期相关蛋白表达的影响Fig. 5 Effect of cotton seed water extraction on the expression of cell cycle-related proteins in bovine skeletal muscle satellite cells

3 讨论

棉花籽是棉花加工过程中的副产品，含有大量纤维和一定的粗蛋白、粗脂肪以及少量的五碳聚糖、木质素等物质[9]。在国外，全棉籽作为一种高能、高粗蛋白、高纤维含量的饲料已经被广泛应用于奶牛生产[10]，但是棉花籽水提物对细胞有何影响尚未见报道。然而，在动物生产系统中使用棉籽副产品有一个很大的限制因素，即棉酚的存在，棉酚是一种有毒化合物，存在于整个棉花植株中[11]。所以本试验采用将棉花籽水提物加热煮沸的方法去除棉酚，经HPLC-MS检测显示煮沸后的棉花籽水提物中已检测不到游离棉酚，说明此方法能够有效地去除游离棉酚，同时棉花籽水煮后固体部分可以用于动物饲料。本试验通过CCK-8法检测了水提物作用48 h后的细胞活力，结果显示，棉花籽水提物可以提高细胞活力，且对细胞形态没有影响。细胞活力的升高依赖于细胞周期的正常运转，各种周期蛋白在此过程中发挥重要作用。周期蛋白表达水平上调，可以促进细胞增殖分化[12-17]。本试验结果显示棉花籽水提物作用牛骨骼肌卫星细胞后CCND1和CCNB1蛋白表达水平升高，表明棉花籽水提物可以使牛骨骼肌卫星细胞增殖。异槲皮素苷[18]、阿魏酸[19]、胸腺嘧啶核苷[20]、熊果苷[21]也均为棉花籽的成分，并且也具有促进细胞增殖分化的作用，但棉花籽水提物中是否含有这些物质、棉花籽水提物成分如何进入细胞发挥作用等问题还有待进一步研究。

4 结论

经不同时间处理后棉花籽水提物中未检测到棉酚，浸泡20 h和25 h的棉花籽水提物均可提高细胞活力，其中20 mg·L-1的棉花籽水提物效果最显著；20 mg·L-1的棉花籽水提物浸泡20 h能促进牛骨骼肌卫星细胞周期相关CCND1和CCNB1蛋白的表达。结果表明，棉花籽水提物可以促进牛骨骼肌卫星细胞增殖，此研究结果可为棉花籽的开发应用提供实验依据。