miRNA在胃肠道间质瘤发生发展及诊治中作用的研究进展

姚志恒，钱波

安徽医科大学第二附属医院，合肥 230000

胃肠间质瘤(GIST)是最常见的胃肠道间叶组织来源肿瘤，可发生于消化道的任何部位，以胃(约60%)和小肠(约35%)多见，也有少数病例可发生在消化道以外。现已证明，原癌基因c-kit和PDGFRA的获得性突变是GIST发生的中心事件，但有关GIST的发病机制、早期诊断和耐药等方面仍存在诸多难题。微小RNA(miRNA)是一种小的(21～25个核苷酸)非编码RNA，其与胃癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤的发生发展密切相关。GIST作为常见的胃肠道肿瘤，miRNA在肿瘤细胞增殖、分化和凋亡等过程发挥重要作用。近些年来，有关miRNA与GIST发生发展、诊断、治疗相关性的研究越来越多，发现两者之间有密切的联系。现就miRNA在GIST发生发展、诊断、治疗中的作用研究进展情况综述如下。

1 miRNA在GIST发生发展中的作用

1.1 miRNA与GIST增殖与迁移 魏伟等[1]通过miRNA芯片与RT-PCR技术对比检测间质瘤细胞与正常细胞中的miRNA，显示胃间质瘤有特异性的miRNA表达谱，通过上调miR-3178和miR-193a-5p的表达可能抑制间质瘤细胞增殖、促进凋亡。廖玉婷等[2]利用miRNA芯片及PCR技术从间质瘤细胞中筛选出10个差异性表达的miRNA，发现miR-301a表达上调最明显，其表达量与性别、年龄、肿瘤发病部位等因素无关，与肿瘤危险度分级、肿物直径、肿物细胞核分裂象和坏死情况相关，表明过表达miR-301a能显著增强GIST细胞的增殖能力。Ling等[3]发现，miRNA-182在人GIST中的表达上调，其过表达增加了GIST-T1细胞的生长、增殖，减少凋亡，促进GIST细胞的集落形成和迁移。已有研究表明，miR-218能够抑制骨肉瘤细胞的侵袭和迁移。Tu等[4]发现，miR-218在GIST中表达下调，其靶基因为KIT，通过负载纳米颗粒的miR-218转染，不仅可以提高表达的稳定性，而且对细胞增殖的抑制作用明显增强。Yamamoto等[5]通过对19例GIST进行miRNA芯片分析，发现miRNA-133b在GIST中低表达，尤其是在高度恶性的间质瘤患者中下调更为明显，进一步的作用靶点分析提示miRNA-133b下调后导致fascin-1(一种肌动蛋白结合蛋白)的过表达，fascin-1被证实促进肿瘤的增殖与转移，该实验证明下调miRNA-133b促进间质瘤细胞的转移可能是通过上调fascin-1的表达实现的。张林等[6]发现，miR-376-3p在胃间质瘤中明显下调，对转染miR-376-3p后的间质瘤细胞通过Western blotting法和PT-PCR法、CCK8法、流式细胞仪、Transwell法分别检测人类同源基因7(CASP-7)表达、细胞活性、凋亡率及迁移能力，结果显示CASP-7 mRNA及蛋白水平显著上调，细胞增殖、迁移能力明显受到抑制，细胞凋亡增强。Isosaka等[7]使用TaqMan miRNA芯片分析miRNA表达谱、亚硫酸氢盐焦磷酸测序分析DNA甲基化，发现miR-34a和miR-335表达下调，且它们的CpG岛在GIST-T1细胞和大多GIST标本中被甲基化。转染后高表达的miR-34a和miR-335，可以抑制GIST-T1细胞的增殖，并且miR-34a能够抑制细胞的迁移和侵袭。

1.2 miRNA与GIST增殖凋亡的调控 Pantaleo等[8]使用miRNA微阵列对KIT/PDGFRA基因突变体和KIT/PDGFRA野生型GIST细胞株进行全基因组miRNA检测，发现存在3个miRNA-mRNA潜在的调控网络[IGF1R→miR-139-5p/miR-455/let-7b、周期蛋白依赖激酶6(CDK6)→miR-139-5p/let-7b和CD44→miR-330-3p]，其中miR-139-5p、let-7b、miR-455-5p、miR-330-3p在KIT/PDGFRA突变体GIST中表达上调。第1个IGF1R调节网络中IGF1R是激素胰岛素样生长因子1的细胞表面受体，可引起细胞的过度增殖，通过上调miR-139-5p、miR-455、let-7b能够调控IGF1R，抑制细胞的生长，其中前两者起到主要的调控作用，后者作用相对次要；第2个CDK6调控网络，CDK6作为一种细胞周期调节剂，可以促进哺乳动物细胞增殖，过表达的miR-139-5p、let-7b可以下调CDK6的表达，抑制细胞的增殖，提示在GIST中发挥肿瘤抑制因子的作用；第3个CD44调控网络中，CD44是具有多种生物学功能的因子，可以通过多种途径介导肿瘤生长和转移，包括血管生成、细胞存活和细胞迁移，实验发现miR-330-3p可以和CD44结合，可能抑制GIST细胞的增殖，促进细胞凋亡。miRNA可能通过直接调控CD44、CDK6等信号因子的表达，从而影响GIST的细胞学功能，促进或抑制肿瘤的生长转移。Wang等[9]研究发现，miR-148b-3p在GIST中表达下调，进一步的靶基因预测分析显示miR-148b-3p可以通过直接与KIT的3′-UTR结合来调控KIT表达，并且对细胞增殖、迁移和侵袭起抑制作用，研究还发现miR-148b-3p能与伊马替尼产生协同抑制作用，增强细胞对伊马替尼的敏感性。Liu等[10]发现，miR-137在GIST的临床标本中表达显著下调，miR-137的表达可以通过下调Twist1调控EMT从而减少GIST细胞迁移，导致G1细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。Koelz等[11]发现，与其他肿瘤相比，miR-221和miR-222在大多数GIST中表达均下调，miR-221/222表达水平与KIT的表达密切相关，尤其是在KIT表达阴性和阳性肿瘤之间相关性更加密切，miR-221和miR-222的表达水平在KIT阳性的GIST中明显受到抑制，而在KIT阴性的GIST中表达完全相反。Ihle等[12]研究认为，miR-221和miR-222可以降低细胞活力、诱导细胞凋亡、通过KIT/AKT信号级联调控增殖。Yun等[13]通过分析三种miRNA(miR-221、miR-193a和miR-494)对KIT mRNA的下调效率，发现miR-494是惟一诱导KIT显著下调的miRNA，进一步调控机制研究显示，miR-494的抑制作用主要是通过直接作用于其靶基因KIT和Survivin，进而干扰细胞周期实现的。其中Survivin是miR-494的靶基因，其表达与miR-494在GIST组织中的含量呈负相关。Kim等[14]发现，GIST中miR-494表达下调，并且与KIT表达水平呈负相关，通过诱导miR-494过表达，可以下调KIT信号转导通路下游分子AKT和STAT3的表达，导致细胞凋亡，并伴有G1期和S期细胞比例增加。

1.3 miRNA与GIST恶性度 肖军等[15]通过对正常组织、低危GIST、高危GIST中miRNA的对比分析，发现miR-17-3p、miR-17-5p及miR-20a-5p在GIST中表达显著下调，其中miR-17-3p、miR-17-5p在正常组织中的表达与肿瘤组织比较差异具有统计学意义，但是在低危组和中高危组GIST中表达无明显差异；miR-20a-5p的表达在正常组织、低危组和中高危组GIST之间均有差异性，且随着恶性度增加而表达下降，表明miR-17-3p、miR-17-5p、miR-20a-5p与肿瘤的侵袭、转移与恶性度等相关，尤其miR-20a-5p在间质瘤的恶性转归中可能存在重要作用。姚冬雪等[16]发现，miRNA-206在胃间质瘤中表达下调，且在核分裂像≥5/50 HPF及Fletcher分级中/高危病例中miRNA-206下调更为明显，其他病理因素(性别、年龄、肿瘤直径)并没有对miRNA-206的表达产生明显影响，说明miRNA-206与胃间质瘤恶性度相关。Niinuma等[17]通过miRNA微阵列分析了32例GIST患者的miRNA表达谱，发现miR-186表达下调，尤其在转移复发GIST中下调更明显，表明该miRNA的下调促进了肿瘤细胞的迁移，与患者风险等级和预后不佳有关。Niinuma等[18]利用miRNA微阵列及PT-PCR技术对GIST标本进行分析，发现miR-196a在高危GIST中明显上调，而在低危或中危GIST中明显下调，表明miR-196a与GIST标本的高危分级、转移和预后不佳可能相关。Gyvyte等[19]使用RNA测序法对15对GIST标本及其周围正常组织进行了高通量miRNA分析，发现110个miRNA(上调34个，下调76个)在GIST中差异表达。选择其中高表达的21个miRNA进一步研究，发现19个miRNA与GIST相关，其中6个miRNA(miR-133a-3p、miR-133b、miR-200c-3p、miR-509-3p、miR-483-5p、miR-675-3p)已经被证明在GIST中具有调控作用(前三者下调，后三者上调)，其余13个miRNA为新发现与GIST相关的，新发现的相关miRNA包括miR-200家族成员(miR-200c-3p、miR-200a-3p、miR-200b-3p、miR-429、miR-141-3)，这些家族成员在其他研究中显示与肿瘤的预后和诊断相关，另外miR-192/215参与肿瘤相关p53网络，miR-375在胃癌中下调，影响细胞增殖。miRNA富集分析发现，miR-141-3p的表达与KIT基因之间存在高度的负相关，而miR-375只表现为中度负相关，在富集的miRNA中只有miR-200a-3p与PDGFRA表现出显著的负相关性。在miRNA与GIST组织学特性的实验中，通过表型分析显示miR-509-3p表达上调，尤其在上皮样细胞和混合型细胞中高表达，miR-215-5p表达下调，且与GIST的危险程度呈中度负相关，已有研究显示miR-215-5p在结肠癌和胰腺癌中发挥肿瘤抑制因子作用，成为预后不良的生物标志物。

2 miRNA在GIST诊断中的作用

2.1 miRNA与间质瘤良恶性鉴别 Shi等[20]通过基因芯片对差异性表达的miRNA筛选，结果显示GIST恶性组与交界组相比，相差倍数2倍以上的miRNA有14个，上调的有5个(miRNA-720、miRNA-221、miRNA-130b、miRNA-10b、miRNA-135b)，下调的有9个(miRNA-326、miRNA-24-1、miRNA-145、miRNA-488、miRNA-218、miRNA-34a、miRNA-675、miRNA-335、miRNA-505)，其中表达差异最明显的有4个，分别为miR-221(25.58倍)、miR-135b(25.35倍)、miR-675(5.69倍)、miR-218(66.56倍)。以往研究发现，miR-135b与结肠癌、前列腺癌相关；miR-675在结肠癌中起着癌基因的作用，并且可用于鉴别肾上腺皮质腺癌与腺瘤；miR-218可能与非小细胞肺癌、胃癌有关系；miR-221与GIST的恶性程度相关，且在其靶基因KIT阳性的GIST相较于KIT阴性的表达显著降低。同样地，Tong等[21]通过检测不同类型GIST(良性、交界性、恶性)中miRNA表达谱，研究miRNA与GIST恶性进展间的关系，发现在GIST的恶性转归中存在多种miRNA的失调，let-7c、miR-218、miR-488、miR-4683、miR-34c-5p和miR-4773 这6个miRNA在良性GIST与恶性GIST中差异性表达，前四者在良性组中上调，后两者下调；miR-29b-2、let-7c、miR-891b、miR-218、miR-204、miR-204-3p、miR-628-5p、miR-744、miR-29c、miR-625和miR-196a在边缘组和恶性组中差异表达，miR-196a在边缘组中下调，其余上调，let-7c、miR-218、miR-628-5p、miR-204、miR-891b、miR-488、miR-145、miR-891a、miR-34c-5p和miR-196a在非恶性组与恶性组中差异表达，非恶性组中低表达的只有miR-196a和miR-34c-5p，其余的miRNA高表达。在其他的肿瘤研究中发现，let-7c在恶性肿瘤中的低表达促进了细胞的增殖与转移；miR-218可以负调控KIT蛋白的表达，抑制GIST细胞的增殖和侵袭；miR-34c下调了ULBP2的表达，降低了NK细胞对肿瘤细胞的识别能力，可能促进了肿瘤细胞的增殖与转移；miR-196a在癌组织中的上调与肿瘤直径、pT期、pN期及生存时间有关，miR-196a下调可抑制癌细胞增殖。上述实验所筛选出的miRNA有可能成为鉴别间质瘤良恶性以及预后的生物学指标，为后续的治疗提供了有力的临床数据支持，但其检测的准确度及灵敏度有待于进一步的研究。

2.2 miRNA与胃肠道内外间质瘤鉴别 林慧等[22]通过研究miRNA表达谱反映GIST与胃肠道外间质瘤(EGIST)关系，发现GIST肠道表型组与胃部表型组相比，有7个miRNA上调(miR-383、miR-1275、miR-193b、miR-139-3p、miR-663、miR-886-3p、miR-664)，有5个发生下调(miR-30e、miR-186、miR-10a、miR-199b-5p、miR-218)。比较GISTs和EGISTs的表达谱发现，仅有3个miRNA的表达差异具有统计学意义，提示GISTs和EGISTs的miRNA表型基本相似，也支持了绝大部分EGISTs实质上来源于GISTs的观点。通过该实验我们可以得知胃肠道很可能成为间质瘤的原发部位，并且转移到胃肠道外。

3 miRNA在GIST治疗中的作用

3.1 miRNA与伊马替尼耐药性检测 Kou等[23]通过检测继发性伊马替尼耐药GIST患者、伊马替尼敏感GIST患者和健康对照组血清miRNA表达谱，发现miR-518e-5p和miR-548e在继发性伊马替尼耐药组血清中明显增高，且miR-518e-5p对于伊马替尼耐药、敏感GIST患者以及正常对照组区分的灵敏度为99.8%，特异性为82.1%，与临床病理特征(核分裂水平、转移等)无相关性。该实验表明血清miR-518e-5p可作为是一种潜在的生物标志物，成为早期检测和诊断继发性伊马替尼耐药GIST的新思路。

3.2 miRNA与伊马替尼敏感性 Zhang等[24]利用微列阵分析发现了与伊马替尼耐药性相关的5个关键miRNA，在这5个miRNA中，与伊马替尼耐药灵敏度显著相关的有miR-28-5p和miR-125a-5p。这2种miRNA的高表达，可以上调KEGG和GnRH信号通路的表达，进而影响GIST对伊马替尼的药物灵敏度，并且该miRNA的表达情况和GIST患者伊马替尼治疗效果密切相关。支小飞等[25]发现，伊马替尼耐药GIST细胞株中miRNA-145表达明显下调，同时三磷酸腺苷结合盒转运蛋白亚家族C成员1(ABCC1)蛋白表达增多，转染耐药GIST细胞后高表达miRNA-145，ABCC1蛋白表达明显下调，对于伊马替尼灵敏度也显著增强。提示miRNA-145可能通过下调ABCC1蛋白的表达，增加伊马替尼耐药GIST细胞的药物灵敏度。Cao等[26]研究伊马替尼耐药GIST细胞中miRNA-21的表达，发现miRNA-21表达明显下调，Bcl-2基因表达上调，通过转染高表达miRNA-21，可以逆转GIST细胞对伊马替尼的耐药，抑制细胞增殖，并且增加凋亡。相关机制研究提示，miRNA-21可能通过和Bcl-2基因的3′-未翻译区(3′-UTR)结合，下调Bcl-2基因的表达，从而影响GIST细胞对伊马替尼的灵敏度。Durso等[27]发现，通过上调miRNA-221/222的表达，可以增加GIST细胞对伊马替尼的灵敏度，其机制可能是通过影响KIT基因的表达，增加细胞的凋亡和抑制细胞增殖。

3.3 miRNA与伊马替尼耐药 Shi等[28]通过基因芯片检测GIST和伊马替尼耐药患者组织，发现表达差异的miRNA有10种，其中miR-1260b、miR-2964a-5p、miR-3907、miR-491-3p表达上调，miR-518a-5p、miR-4466、miR-595、miR-221-3p、miR-3145-3p、miR-3655表达下调。已有研究提示，miR-518a-5p可能起到抑癌因子的作用，进一步研究GIST中miR-518a-5p的功能，发现miR-518a-5p可以和PIK3C2A基因的3′-UTR结合，下调该基因的表达。在GIST耐药细胞中，miR-518a-5p表达下调，可以上调PIK3C2A的表达，参与GIST对伊马替尼的耐药。石园等[29]利用基因芯片分析伊马替尼耐药GIST中的miRNA的表达，发现差异表达的miRNA有13种，其中表达差异最明显的是miR-15a、miR-1280、miR-320a、miR-15a表达上调，后两者表达下调，提示miR-15a、miR- 1280、miR-320a可能与GIST耐药相关，但未作进一步的机制研究。不过在其他肿瘤中如胃癌，miR-15a可能通过作用于靶基因BCL-2、MCL1、ETS1、JUN等促进细胞凋亡、抑制细胞增殖；在膀胱癌中，miR-1280可通过调控靶基因ROCK1的表达，抑制膀胱癌侵袭与转移；miR-320a可通过直接作用β-catenin抑制人结肠癌细胞增殖。Gao等[30]发现，miR-320a在伊马替尼耐药患者中低表达，该基因表达较低的患者，更易出现术后早期伊马替尼耐药。以上研究提示miRNA可能通过调控ABCC1、Bcl-2、PIK3C2A等基因表达，进而影响与凋亡相关的信号通路如Wnt通路、IGF通路、TRPC5等，抑制间质瘤细胞的凋亡，从而导致耐药。

综上所述，间质瘤是胃肠道常见的肿瘤之一，其生物学特性和癌症有明显差异，诊断和治疗是现在研究的热点。miRNA是一种非编码RNA，被证实和间质瘤增殖、分化、凋亡等生物学功能相关，在诊断方面也有特殊的意义。今后，通过研究GIST中差异性表达的miRNA，进一步分析其作用靶点、作用机制及通路，对于阐释GIST发生发展机制、辅助临床诊断以及药物治疗等有着重要的临床研究价值。