冠状病毒生物学特性、基因组结构及其诱导的免疫应答研究进展

汪婷，项前，金培培，卢文斌，林省伟，郭品豪，卞金俊

海军军医大学长海医院，上海200433

2019年12月中国武汉出现的新型冠状病毒导致病毒性肺炎爆发，截至2月10日，全国累计报告新型冠状病毒感染的肺炎确诊37 626例，死亡1 016例，已引起全球极大关注。在新冠状病毒基因组序列公布后，2020年2月12日国际病毒分类委员会(ICTV)将新病毒命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，世界卫生组织(WHO)将这一病毒导致的疾病命名为COVID-19，国内简称新冠肺炎。冠状病毒与宿主免疫系统间的相互作用是病毒感染的基本发病机制，而机体的免疫应答对于控制和消除冠状病毒感染至关重要。现有关于SARS-CoV-2的研究基本以新病毒的生物学特性、基因结构、流行病学、临床特征为主，涉及其免疫反应的研究较少，这与之前严重急性呼吸综合征(SARS)以及中东呼吸综合征(MERS)的文献发表规律是一致的。SARS-CoV-2与SARS-CoV具有遗传相似性，因此，SARS-CoV、MERS-CoV相关的免疫应答也是研究SARS-CoV-2免疫应答的基础。本文将冠状病毒的生物学特性、基因组结构及其诱导的免疫应答研究进展综述如下。

1 冠状病毒的生物学特性

冠状病毒具有广泛的自然宿主，是严重危害人类和动物健康的病原体，在基因型上分为四个属，即α、β、γ和δ冠状病毒。α和β冠状病毒可以感染人类及哺乳动物，而γ和δ冠状病毒一般感染鸟类和鱼类。目前已知2个α冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-NL63)和4个β冠状病毒(HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV)可以感染人类，其中HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1仅诱发轻度上呼吸道疾病，在极少数情况下可引起严重感染。感染SARS-CoV和MERS-CoV后，患者在早期可能无症状，而潜伏期后可出现致命的下呼吸道感染和肺外表现，如肝损伤、肾功能不全。与SARS-CoV相似，感染SARS-CoV-2的患者主要临床表现为发烧、咳嗽、胸痛、腹泻等，重症患者出现继发感染、心脏损伤甚至死亡[1]。序列分析表明，SARS-CoV-2具有典型的冠状病毒基因组结构，属于β冠状病毒。而基于冠状病毒的系统树分析表明，SARS-CoV-2与bat-SL-CoV ZC45、bat-SL-CoV ZXC21更相似，同一性达88%；据此推测，SARS-CoV-2的自然宿主也可能是蝙蝠，但在从蝙蝠到人的传染过程中很可能存在未知的中间宿主[2]。

2 冠状病毒的基因组结构

冠状病毒是直径为120～160 nm的球形颗粒，其基因组为长26～32 kb的单股正链RNA，是已知RNA病毒中基因组最大的病毒。与细胞mRNA类似，冠状病毒包含5′帽端和3′poly(A)尾端。近5′端三分之二的基因组包含两个重叠的开放阅读框(ORF)，即ORF1a和ORF1b。ORF1a翻译产生多蛋白1a(pp1a)，核糖体移码使ORF1b翻译产生pp1ab。这些多蛋白编码16种非结构蛋白(NSP)，其中大多数参与病毒基因组复制。近3′端三分之一的基因组编码一系列结构蛋白，即棘突蛋白(spike S)、包膜蛋白(envelope E)、膜蛋白(membrane M)、核衣壳蛋白(nucleocapsid N)。此外，不同的冠状病毒还编码特殊的辅助蛋白，如3a/b蛋白、4a/b蛋白。最近研究发现，SARS-CoV-2的基因组编码8种辅助蛋白，即3a、3b、p6、7a、7b、8b、9b和orf14[3]。这些辅助蛋白分子量低、表达少，不参与构建冠状病毒的基本结构。结构蛋白为了适应环境的变化而具有变异性，相比之下，非结构蛋白更保守[4]。

3 冠状病毒诱导的免疫应答

3.1 先天性免疫应答

3.1.1 介导干扰素(IFN)应答 冠状病毒感染时，哺乳动物的先天性免疫系统是第一道重要防线，其中Ⅰ型IFN是宿主抗病毒的主要效应因子，可限制病毒传播、促进巨噬细胞吞噬抗原及自然杀伤细胞(NK)清除受感染细胞和T/B细胞[5]。因此，阻断IFN产生可以直接促进冠状病毒在宿主中的存活。病毒侵入宿主后，模式识别受体(PRR)最先识别冠状病毒核酸，募集特定的衔接蛋白以激活干扰素调节因子3(IRF-3)和IRF-7，并促进机体合成Ⅰ型IFN。然后，Ⅰ型IFN激活下游JAK/STAT信号通路，促进干扰素刺激基因(ISG)表达，最终抑制病毒的复制和组装。此外，编码IFN的基因受NF-κB的调控，NF-κB在感测病毒核酸的信号转导途径中具有至关重要的作用。NF-κB的激活是一把双刃剑，NF-κB正常情况下可以介导适当的先天性和适应性免疫反应，但其功能失调可导致炎症性疾病及肿瘤发生[6]。NF-κB与 IκB(NF-κB的阻遏蛋白)结合，被锚定在细胞质中；IκB受到病毒刺激后被磷酸化，解除与NF-κB结合，NF-κB被释放进入细胞核，从而促进相关的抗病毒基因表达。

IRF-3是IFN-β、干扰素刺激基因56(ISG56)、干扰素γ诱导蛋白10(IP-10)和其他抗病毒基因的关键转录因子。在未感染冠状病毒的细胞中，IRF-3 位于细胞质中，并处于非活性状态。感染冠状病毒后，IRF-3被磷酸化和二聚化，之后进入细胞核并上调IFN-α和IFN-β基因转录，同时募集转录共激活因子cAMP-反应元件结合蛋白(CREB)，从而启动IFN-β mRNA合成。IFN-β合成增加，与其细胞表面的受体结合，促进与抗病毒、调节免疫相关的蛋白质合成。IFN-β也参与了IFN-α的诱导，从而进一步增强了抗病毒反应[7]。但是，冠状病毒是不断变异进化的，可编码多种蛋白来对抗IFN系统的抗病毒作用。研究表明，SARS-CoV的N蛋白具有拮抗宿主的IFN应答以逃避宿主抗病毒免疫的作用，MERS-CoV的M、4a蛋白可拮抗Ⅰ型IFN的合成[8]。

3.1.2 介导视黄酸诱导基因(RIG-I)样受体(RLR)表达 RLR包括RIG-I(DDX58)、黑色素瘤分化相关基因(MDA-5)和LGP-2，主要识别RNA病毒的核酸。RLR具有DExD/H-box RNA解旋酶结构和C′末端终止结构(CTD)，而RIG-I和MDA-5具有N′末端胱天蛋白酶募集结构(CARD)，可与下游衔接子线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)相互作用。C端RNA解旋酶和CTD结构可以识别RNA[9,10]。RIG-I可被多种RNA病毒感染激活，包括CoVs、仙台病毒(SEV)和丙型肝炎病毒(HCV)等。短双链上含有三磷酸结构是病毒RNA的共同特征，而RIG-I可以识别5′端含有双碱性酸的双链RNA。当病毒的5′-三磷酸端被CTD结构识别时，ATP依赖性构象变化使CTD结构与双链RNA形成复合物，之后CARD结构解除自我抑制状态，并与MAVS相互作用[11]。晶体结构分析表明，与RIG-I一样，MDA-5的解旋酶和CTD结构也被双链RNA包围，但是MDA-5的CTD结构缺少帽子结构(CTD与RNA 5′端的三磷酸相互作用需要帽子结构)，可以直接与双链RNA相互作用[12]。

3.1.3 调节细胞凋亡 冠状病毒是单股正义链RNA病毒，在复制的过程中产生双链RNA(dsRNA)中间体。dsRNA是冠状病毒特有的病原体相关分子模式(PAMP)，可引起一系列特定的免疫反应。巨噬细胞具有多个dsRNA检测器，具有检测病毒感染和增强先天抗病毒免疫的作用。dsRNA检测器被激活将导致一系列反应，如IFN的产生、巨噬细胞快速凋亡和保护性免疫反应等。然而，许多冠状病毒进化并适应宿主后，可在巨噬细胞中感染和传播，同时并不会激活dsRNA检测器，例如MERS-CoV的NSP4a、NSP4b、NSP15可抑制dsRNA检测器激活。宿主的蛋白激酶R(PKR)可以磷酸化翻译启动因子2α(eIF2α)，抑制病毒翻译。而MERS-CoV的NSP4a编码一种dsRNA结合蛋白，可限制PKR激活[13]。当宿主检测到病毒dsRNA时，可激活IFN诱导的寡腺苷酸合成酶(OAS)-RNase L途径。活化的RNase L可切割病毒和宿主单链RNA，导致翻译停滞和细胞死亡，以防止病毒复制和传播。而MERS-CoV的NSP4b编码磷酸二酯酶，可抑制RNase L的活性，从而增强病毒的复制和传播能力，同时可导致细胞内IFN生成减少[14]。

3.2 适应性免疫应答

3.2.1 细胞免疫反应 T细胞尤其是CD4+T细胞和CD8+T细胞，在抗病毒过程中发挥重要作用。有研究采用ad5-hdp4转染BALB/c小鼠以清除其体内T细胞，随后将之与对照组和B细胞缺陷的小鼠进行比较，结果表明T细胞可以在感染小鼠的肺部存活，并破坏被感染的细胞，表明T细胞而非B细胞在抑制MERS-CoV感染的过程中发挥重要作用[15]。CD4+T细胞更容易受到MERS-CoV感染，其通过激活T细胞依赖性B细胞来促进病毒特异性抗体的产生。而CD8+T细胞具有细胞毒性，可以杀死病毒感染的细胞，并诱导免疫损伤。SARS-CoV可导致患者的肺间质被炎症细胞浸润，CD8+T细胞约占浸润细胞总数的80%[16]。此外，SARS-CoV感染时，CD8+T细胞的损耗不会影响病毒复制；而CD4+T细胞的耗竭会导致肺部浸润的淋巴细胞、中和性抗体和细胞因子减少，从而导致严重的间质性肺炎和病毒清除延迟。在冠状病毒感染后期，T细胞的耗竭可能会延长病毒感染时间，并促进病毒存活。另外，辅助性T细胞可通过NF-κB信号通路产生促炎细胞因子；其中，IL-17可将单核细胞和中性粒细胞募集到炎症感染部位，并激活其他下游细胞因子和趋化因子级联反应，例如IL-1、LL-6、IL-8、IL-21、TNF-β和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)等。有研究从处于SARS恢复期的患者中筛选了SARS-CoV特异性T细胞，并检测到了针对SARS-CoV结构蛋白的记忆性T细胞反应；结果表明，T细胞对SARS-CoV S蛋白和其他结构蛋白(包括M和N蛋白)的反应是持久的(可持续长达感染后11年)[17]。该研究为设计由病毒结构蛋白组成的SARS疫苗提供了依据，也给新型冠状病毒的疫苗研制提供了可靠参考。

对于SARS-CoV-2，最近有研究对2019年12月～2020年1月武汉市汉阳医院收治的522例COVID-19患者的临床资料进行回顾性分析，结果表明在感染SARS-CoV-2的患者(特别是ICU中的重症患者)中，其总T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞数量大大减少，且T细胞计数与血清IL-6、IL-10、TNF-α水平及患者生存率呈负相关关系；随着患者的病情发展，T细胞上的衰竭标志物程序性死亡受体1(PD-1)和T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(Tim-3)表达增加，T细胞进一步衰竭；提示在COVID-19患者中，IL-10、IL-6、TNF-α等细胞因子可能直接介导T细胞衰竭，由此建议ICU的高危患者在疾病早期采取预防T细胞降低的治疗方法可能会改善其疾病转归[18]。此外，柳叶刀杂志发表了首份COVID-19病死患者的病理报告，结果发现患者CD4+和CD8+T细胞数量显著减少，但人类白细胞抗原DR(HLA-DR)和CD38双阳性的T细胞比例升高，提示其处于过度激活状态；CD8+T细胞中含有高浓度的细胞毒性颗粒，其中颗粒溶素和穿孔素双阳性的细胞占30.5%；该研究指出，淋巴细胞减少是COVID-19患者的典型特征，T细胞过度激活和CD8+T细胞的高细胞毒性可能与患者病情较重、预后较差有关[19]。

3.2.2 体液免疫反应 体液免疫对控制冠状病毒持续感染很重要，B细胞具有分泌相应抗体和免疫记忆的功能。体内的抗体反应是多种单克隆抗体(mAb)的动态性综合反应过程，它们共同作用于病毒包膜糖蛋白(E)上的不同抗原结构域。体外实验表明，人单克隆抗体m336与MERSCoV刺突蛋白的受体结合区相互作用，m336能有效地中和MERS-CoV，使患者肺部病毒RNA滴度降低40 000～90 000倍[20]。研究表明，用高滴度超免疫血浆或单克隆抗体m336可以缓解MERS-CoV感染猴子的临床症状，但仅在超免疫血浆组中发现呼吸道病毒载量降低，且二者尚不能完全预防该疾病[21]。研究表明，与对照组相比，SARS-CoV感染后的雪貂能以更快的速度产生更强的中和性抗体反应，但其肝组织中也发生了强烈的炎症反应，证明SARS-CoV的棘突蛋白表达升高与肝炎的发生及加重均密切相关[22]。

由于SARS-CoV和SARS-CoV-2的结构相似，并通过结合相同的宿主受体进入宿主，有研究检验了两种病毒受体结合区(RBD)之间是否存在抗体交叉反应性；结果表明，靶向SARS-CoV RBD的单克隆抗体并不结合SARS-CoV-2的RBD，SARS-CoV的单克隆抗体不具备免疫交叉反应性，对SARS-CoV-2的感染无效[23]。最近的一项前瞻性队列研究对34例SARS-CoV感染的医护人员进行了长达13年的跟踪调查，结果显示其抗SARS-CoV IgG滴度在2004年达峰后逐渐下降，直到2015年仍保持在很高的水平；该研究提示，冠状病毒感染后机体发生体液免疫应答，可提供长达12年的保护性免疫力[24]。

3.2.3 补体系统应答 补体系统是宿主对抗冠状病毒感染的免疫应答的重要组成部分。补体系统有助于先天性免疫系统检测和抵抗外来抗原，也是适应性免疫系统中具有宿主敏感性且非特异性的补充体系[25]。过度的补体反应可损害宿主组织，因此可以通过适度抑制血清中的蛋白来严格控制补体系统。C3是补体系统的重要组成成分，有研究以C3缺陷型小鼠与C57BL/6J小鼠为研究对象，验证了补体系统在SARS-CoV发病机制中的作用。结果显示尽管两者肺内的病毒载量相同，但是C3缺陷型小鼠肺组织及血清中的细胞因子及趋化因子水平降低，呼吸障碍程度轻；提示SARS-CoV感染后激活的补体系统可以调节全身性促炎反应。

综上所述，宿主的先天性及适应性免疫系统实现了对病毒的高效性杀伤清除，宿主免疫功能不全会使得病毒复制增加，而过强的免疫反应会诱发免疫病理状况，导致组织损伤；另一方面，病毒已进化出多种机制来逃避和拮抗宿主的免疫反应，如逃避体液免疫识别、干扰细胞免疫应答能力、干扰免疫效应因子功能等[26,27]。因此，了解冠状病毒与宿主免疫系统间的相互作用是科学防治该病毒的基础。