Mus81基因沉默对Hep3B人肝癌细胞系增殖和凋亡的影响

张芳雍 谭国钳 曾裕文 吴帆

暨南大学医学院附属广州红十字会医院肝胆外科（广州510220）

Mus81（甲磺酸盐及紫外线敏感性81号基因）是近年来发现的一种DNA修复基因，在维持细胞基因组稳定性中发挥重要的生物学功能［1-2］，因而曾被认为是一个肿瘤抑制基因［3］。然而最近的研究发现，Mus81的生物学功能具有多样性，也可发挥促进肿瘤发展的作用［4］。YIN等［5］研究就发现Mus81可通过调控上皮间质转化（EMT）促进胃癌细胞系的迁移。笔者前期研究也发现，Mus81沉默可逆转人肝癌和结肠癌细胞系的化疗耐药性［6-7］，并可抑制人结肠癌细胞系HCT116的增殖、促进其凋亡［8］，提示Mus81可能是一个潜在的肿瘤治疗靶点，但Mus81在人肝癌细胞系增殖凋亡中的作用尚未明确。为此，本研究以慢病毒介导的小干扰RNA（siRNA）沉默人肝癌细胞系Hep3B中Mus81基因的表达，观察Mus81对肝癌细胞增殖凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料Hep3B肝癌细胞系、siRNA慢病毒载体GV248、293T细胞、包装质粒pGC-LV、pHelper1.0和pHelper2.0均购自上海吉凯基因化学技术有限公司；实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）试剂盒购自日本TaKaRa公司（TP800）；MTT试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；Giemsa染液购自美国chemicon公司；凋亡试剂盒购自美国Ebioscience公司；碘化丙锭（PI）染色试剂盒购自德国Sigma公司。

1.2 慢病毒介导的siRNA设计针对Mus81基因的短发卡RNA（shRNA）序列如下（由上海吉凯基因化学技术有限公司合成）：正义链：5′-CCGGGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGAT -CCAGTACCAACTCTTTTTG-3′；反义链：5′-AATTCAAAAAGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGATCCAGTACCAACTC-3′；阴性对照序列为：正义链：5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′；反义链：5′-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAAGTTCTCTACGTGACACGTTCGGAGAA-3′。将上述shRNA序列形成的DNA双链与siRNA慢病毒质粒GV248连接，再利用Lipofectamine 2000将上述质粒分别与pGC-LV、pHelper1.0和pHelper 2.0慢病毒包装载体共转染至293T细胞，生成Mus81-siRNA和及阴性对照慢病毒。将感染上述2种慢病毒的肝癌Hep3B细胞系分别命名为Mus81-siRNA组（实验组）和siRNA-NC组细胞（阴性对照组）。感染3 d后采用荧光倒置显微镜（micropublisher 3.3RTV，日本奥林帕斯公司）观察两组细胞的慢病毒感染效率。

1.3 qRT-PCR 检测Mus81 基因干扰效率根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书提取Mus81-siRNA组和siRNA-NC组细胞的总RNA，在荧光定量PCR仪行PCR检测，反应条件为：95 ℃预变性15 s，然后95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共进行45个循环。Mus81基因引物：上游引物：5′-CTACAGCACTTCGGAGACG-3′；下游引物：5′-GGTAGAGCACCAGCAGTATCA-3′。内参管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物：上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。采用2-ΔΔCT法分析Mus81基因表达水平。

1.4 MTT检测将处于对数生长期的Mus81-siRNA组和siRNA-NC组细胞经胰酶消化后重悬成细胞悬液，以2 000个细胞/孔接种于96孔板，每组设5个复孔。铺板后置37 ℃5%CO2培养箱培养，于第2天开始每孔加入10 μL的MTT（5 mg/mL），无需换液。于检测前4 h，吸弃培养液，每孔加入100 μL二甲基亚砜（DMSO）终止反应，酶标仪490 nm检测吸光度（OD）值，绘制两组Hep3B细胞系的生长曲线。

1.5 细胞克隆形成检测两组细胞以800个细胞/孔接种于6孔板培养板中，每个实验组设3个复孔，将接种细胞培养到14 d，中途每隔3 d进行换液。实验终止时磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞1次后每孔加入1 mL多聚甲醛，固定细胞30 ～60 min，PBS再次洗涤后加入GIEMS染液500 μL，染色20 min。ddH2O洗细胞至洗净板上背景，克隆计数。

1.6 细胞凋亡检测取两组细胞于5 mL离心管中，每组设三个复孔，以1×binding buffer洗涤细胞，1 500 r/min离心5 min后收集细胞。以1 × staining buffer重悬细胞后取细胞悬液100 μL（1 × 105细胞），加入5 μL annexin V-APC染色，室温避光10 ～15 min，转移至流式上机管中行流式细胞检测。

1.7 细胞周期检测收集两组细胞于5 mL离心管中，每组设三个复孔，4 ℃预冷的PBS洗涤细胞沉淀1次，1 500 r/min离心5 min，收集细胞于4 ℃预冷的70%乙醇固定细胞2 h。以1 500 r/min离心5 min去固定液，PBS洗涤细胞沉淀一次，加入PI染色液重悬细胞沉淀，上机行流式细胞检测。

1.8 统计学方法应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，采用Student′s t检验。生长曲线采用重复测量资料的方差分析。所有分析均为双侧检验，P ＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Mus81 干扰效率荧光显微镜下观察Mus81-siRNA和siRNA-NC两组细胞慢病毒感染效率均高于80%。qRT-PCR检测Mus81沉默后Hep3B细胞发现Mus81-siRNA组Mus81基因的表达水平仅为siRNA-NC组的23.58%［（0.236 ± 0.008）vs.（1.001± 0.059），t = 14.977，P ＜0.001］，即Mus81基因干扰效率为76.42%，见图1。

2.2 Mus81 沉默对Hep3B 细胞生长的影响MTT法绘制出的生长曲线提示Mus81-siRNA组的生长速度明显低于siRNA-NC组（F=2 056.758，P ＜0.001），见图2。

2.3 Mus81 沉默对Hep3B细胞增殖能力的影响平板克隆形成实验显示，Mus81-siRNA组Hep3B细胞形成的克隆数量明显少于siRNA-NC组［（2±1）vs.（54±3），t=29.133，P ＜0.001］，见图3。

图1 慢病毒感染Hep3B 细胞的感染效率及干扰效率Fig.1 Infection efficiency and interference efficiency of lentivirus infected Hep3B cells

图2 MTT 检测结果Fig.2 Results of MTT test

2.4 Mus81 沉默对Hep3B 细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示，Mus81-siRNA组Hep3B细胞的凋亡率是siRNA-NC组细胞的30.25倍［（20.87 ±0.82）%vs.（0.69±0.09）%，t=-42.543，P ＜0.001］，见图4。

2.5 Mus81沉默对Hep3B细胞周期的影响Mus81-siRNA组细胞的G1、S和G2/M期细胞比例分别为（33.77±1.61）%、（36.96±3.09）%和（29.27±2.64）%，siRNA-NC组分别为（42.06±0.40）%、（33.84±0.88）%和（24.10 ± 0.50）%。Mus81-siRNA组G1期细胞比例低于siRNA-NC组（t = 8.657，P ＜0.05），而两组间S和G2/M期细胞比例差异无统计学意义（P ＞0.05］，见图5。

3 讨论

图3 平板克隆形成实验结果Fig.3 Results of plate clone formation experiment

图4 Annexin V-APC 染色法检测结果Fig.4 Results of Annexin V-APC staining method

图5 细胞周期分布结果Fig.5 Results of cell cycle distribution

肝癌是目前全球最常见的恶性肿瘤之一，高居我国恶性肿瘤病死率的第二位［9］。尽管肝癌的手术治疗及靶向药物等取得了很大的进步，但其长期存活率仍不能令人满意［11-12］。而筛选潜在的肝癌治疗靶点可能是提高肝癌治疗疗效、改善患者预后的关键［13-14］。许多研究表明，DNA修复基因与肝癌的易感性和预后密切相关［15］，而靶向抑制这些DNA修复基因可作为肝癌的潜在治疗策略［16-17］。Mus81是定位于人11号染色体长臂的DNA修复基因，属于核酸内切酶超家族，在同源重组修复和非同源末端链接过程中发挥极其重要的作用。MCPHERSON等［3］发现Mus81基因敲除的小鼠中可自发淋巴瘤、乳腺癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤，据此曾认为Mus81是一个肿瘤抑制基因。但YIN等［5］新近的研究结果显示Mus81可通过调控上皮间质转化（EMT）而促进胃癌细胞的迁移。而吴云路等［18］的研究则发现Mus81过表达可抑制SKBR3乳腺癌细胞系的增殖能力并降低该细胞系的侵袭迁移能力。笔者前期的研究也发现Mus81基因沉默后可抑制人结肠癌细胞系HCT116的生长并促进其凋亡［8］，且敲减Mus81基因可逆转人肝癌和结肠癌细胞系的化疗耐药性［6-7］，提示其是一个潜在的肿瘤治疗靶点。上述研究提示Mus81在恶性肿瘤中的作用存在多样性和差异性，在部分肿瘤中发挥着促癌作用，但其在肝癌增殖凋亡中的作用尚未明确［19］，还有待于进一步研究。

本研究首先采用慢病毒介导的siRNA构建沉默Mus81的Hep3B人肝癌细胞系，荧光显微镜观察结果显示Mus81敲减慢病毒的细胞感染效率高于80%，qRT-PCR检测结果显示Mus81基因干扰效率高达76.42%，提示该慢病毒感染和敲减Mus81的效果均很理想，Mus81基因敲减的Hep3B肝癌细胞系已构建成功。为进一步研究Mus81沉默对Hep3B肝癌细胞生物学功能的影响，采用MTT法对Hep3B细胞的生长情况进行检测，结果显示Mus81-siRNA组的生长速度明显低于siRNA-NC组，且Mus81-siRNA组细胞的增殖倍数在每个检测时间点上均低于siRNA-NC组，提示Mus81基因沉默抑制了Hep3B肝癌细胞系的增殖，这与笔者前期研究在HCT116结肠癌细胞系中得到的结果相一致［8］，提示Mus81确实可促进肿瘤细胞的生长。但最近YIN等［5］的研究则发现Mus81沉默对SGC7901和BGC823胃癌细胞系的生长没有明显的影响，提示Mus81沉默对不同的恶性肿瘤细胞的生长具有不同的影响，推测这可能与Mus81在不同恶性肿瘤中的功能存在差异性有关，就如同目前的研究发现Mus81可促进胃癌细胞的迁移却抑制乳腺癌细胞的侵袭迁移一样［5，18］，但这尚待进一步研究。

为探索Mus81沉默抑制Hep3B肝癌细胞生长的机制，采用平板克隆形成实验检测Mus81敲减对Hep3B细胞增值能力和凋亡水平的影响，结果显示Mus81-siRNA组细胞形成的克隆数明显少于siRNA-NC组，仅为后者的3.70%，提示Mus81沉默可明显抑制Hep3B肝癌细胞系的增殖能力，这可能也是Mus81沉默导致Hep3B肝癌细胞生长速度下降的原因之一。鉴于细胞周期的阻滞也可导致细胞生长速度的降低，采用流式细胞仪检测了两组Hep3B细胞的细胞周期分布，结果显示Mus81-siRNA组Hep3B细胞中G1期细胞比例低于siRNANC组，而S和G2/M期细胞比例则无明显差异，提示Mus81沉默可引起Hep3B肝癌细胞系G2/M期阻滞，这与既往研究中发现Mus81沉默可引起HCTll6结肠癌细胞系轻微G2/M期阻滞的结果一致［8］，不仅进一步证明Mus81的确参与了G2/M期的调控，也提示Mus81沉默导致的G2/M期阻滞可能是其抑制Hep3B细胞生长的原因之一。但考虑到Mus81沉默导致的G2/M期阻滞的程度并不足以解释其对Hep3B细胞生长增殖能力的抑制，我们也分析了Mus81沉默对Hep3B细胞凋亡的影响，结果发现Mus81-siRNA组的细胞凋亡率明显高于siRNANC组，是后者的30.25倍，这与既往研究中HepG2、SMMC-7721肝癌细胞系和HCTll6结肠癌细胞系的结果一致［8，19］，显示促进细胞凋亡可能是Mus81沉默抑制Hep3B肝癌细胞生长的重要原因。既往研究通过实时定量PCR检测Mus81敲减组HCT116结肠癌细胞系中凋亡相关基因的表达，发现Mus81可能通过调控Bax、Bcl-2和p53等凋亡相关基因的表达而促进结肠癌细胞凋亡［8］。STC2基因可在Mus81介导下调控肝癌细胞的增殖和凋亡［19］。Mus81是否通过上述信号通路或其他信号通路实现其对Hep3B肝癌细胞系增殖凋亡的调控目前尚不清楚，仍有待进一步的研究。

综上所述，本研究发现Mus81基因沉默可明显抑制Hep3B肝癌细胞系的生长增殖并促进其G2/M期阻滞及凋亡，提示Mus81是一个潜在的肝癌治疗靶点。