新疆红肉苹果果实性状及MYB10启动子基因型鉴定分析

闫 鹏，朱燕飞，梅 闯，冯贝贝，韩立群，艾沙江·买买提，马 凯，王继勋

(新疆农业科学院园艺作物研究所/农业部新疆地区果树科学观测试验站，乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】新疆野苹果(Malussieversii(Ledeb)Roem.)，属蔷薇科(Rosaceae)苹果属(Malus)落叶小乔木，株高 2～10 m，最高可达 14 m。在世界上主要分布于中亚的哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、乌兹别克斯坦、塔吉克斯坦[1]。在我国主要分布于新疆西部山区，新疆野苹果主要分布于新疆伊犁河谷两侧的天山中，其次分布于塔城地区的塔尔巴哈台山南麓和巴尔鲁克山西侧等山地。新疆野苹果是第三纪孑遗物种，被认为是栽培苹果的祖先[2-4]。我国新疆野苹果的环境适应能力强，其果实形态、着色、风味，植株高矮、树形等变异很多，而且由于自然选择形成了许多抗旱、抗寒、抗病虫、耐瘠薄的特异单株[5]。新疆红肉苹果是新疆野苹果的一种，果实和叶子中色素含量高，果皮和果肉在生长过程中和成熟后都保持着红色[6-8]。同时，新疆野苹果及其红肉变型(Malussieversiif.neidzwetzkyana)是世界栽培及红肉苹果的祖先种，不仅遗传多样性丰富，而且是品质育种的基因库[9-10]。近年来，研究植物叶、花、果的类黄酮代谢途径，形成其色泽形成的分子基础，明确花色素苷在植物色泽形成过程中的重要作用。花色素苷的产生与积累使不同的种类和品种乃至组织器官呈现出不同的色彩[6]。研究表明，影响花色素苷生物合成代谢的基因有两类：一类是不同植物共同具有的结构基因，直接编码花色苷生物合成酶类[11]；另一类是调节基因，调节花色苷生物合成结构基因表达的强度和过程及色素在空间和时间上的积累[8]。【前人研究进展】植物中最大的转录因子家族之一，MYB转录因子在拟南芥、玉米、苹果、葡萄等作物的各器官着色的研究表明，MYB类转录因子广泛参与植物花色素苷形成过程的调控，对植物的色泽发育都起到重要作用[12]。在苹果中，已经有3个MYB类转录因子基因得到克隆[13-15]，分别是MdMYB1(DQ886414)，MdMYB10 (EU518248)和MdMYBA(AB279598)，分别从‘Cripps Pink’， ‘Red Field’和MdMYBA(AB279598) 苹果中克隆。其中，MdMYBA在苹果中的表达具有组织、品种和种的特异性，在深红色的品种中表达量高；红肉苹果品种‘Red Field’的MdMYB10 基因的启动子存在多个结合MdMYB10 蛋白的重复序列，重复序列的个数决定了MdMYB10 的表达强度，进而影响红肉苹果的红色程度，该基因组成型过量表达，在整个植株水平产生更多的花青苷，最终导致果肉、叶片、枝条等器官均呈现红色；MdMYB1、MdMYB10和MdMYBA基因的功能也高度相似，表明三者互为等位基因。MdMYB10基因启动子在红色果皮品种中存在6个串联重复结构 (R6)，在绿色果皮品种中仅为1个串联重复 (R1)，启动子上的这种结构差异通过MYB10蛋白的自激活作用造成苹果果皮颜色的差异。MYB10 启动子上差异是否决定叶片色泽发育的过程尚不清楚。【本研究切入点】新疆红肉苹果可以为红肉苹果育种提供良好的基因来源。但是对于新疆红肉苹果的红肉机理研究较少，MYB10是决定红肉的基因，但是其在新疆红肉苹果中启动子类型缺乏进一步的鉴定和研究。【拟解决的关键问题】对29个新疆红肉苹果的启动子类型进行PCR鉴定，通过叶片的启动子类型进而鉴定新疆的红肉苹果的红肉MYB10启动子类型，分析新疆的红肉MYB10启动子类型，及红肉呈色机理提供更充分的理论依据，测定红肉苹果资源的果实的相关性状。

1 材料与方法

1.1 材 料

从新疆采集各个地方的29个红肉苹果品种，全部集中保存于阿克苏苹果试验站。2017～2018年在原生地测定果实性状，2018年5月在选取不同年龄的植株叶片，置于硅胶中干燥保存，用于提取DNA。表1

DNA提取试剂、2×PCR Mix，2 000 Marker、 Gene Green核酸染料购自天根生物公司，其余化学试剂均为国产分析纯。

表1 供试红肉苹果品种及编号Table 1 Varieties and numbers of red fresh apple tested

1.2 方 法

1.2.1 果肉观测及测定

供试果实各取5个，根据《苹果种质资源描述规范和数据标准》[16]对各红肉苹果资源进行统计。

1.2.2 叶片全基因组DNA提取

参照天根的植物DNA提取试剂盒提取苹果叶片的DNA，利用NCBI公布的苹果同源序列(GeneBank:AFP89357.1) 设计引物如下：

基因Gene引物PrimerMcMYB10-F1[17]F1:5′-GCATTGCCTCTTCATCTCTCTACTG-3′R1:5′-TTTTCTCACACTCAGGTTTTCGTTATATCCC-3′MYB10-F2[18]F2:5′-TGCCTGGACTCGAGAGGAAGACA-3′R2:5′-CCTGTTTCCCAAAAGCCTGTGAA-3′

1.2.3 启动子序列鉴定

利用PCR电泳产物条带大小对29个品种MYB10启动子参照电泳条带大小进行初步鉴定分析。参照庞慧[17]和许海峰[18]等的测序结果，进行初步分析。

2 结果与分析

2.1 红肉苹果果肉观测

依据《苹果种质资源描述规范和数据标准》果肉颜色的描述分为10类，用于红肉苹果描述分为淡红和血红两类，28个红肉苹果资源的果肉呈色的红色部分存在于果芯和果皮附近的果肉，红色的果肉在果实中的分布呈丝状或片状，其余部分未出现红色的果肉颜色基本属于乳白或黄绿色；果芯的颜色分为淡红色、红色和血红色。另编号为YN-4资源的果肉未出现红色为乳白色，但在其枝条的韧皮部观测到了红色，并结合此次试验的启动子类型鉴定，该资源具备MYB10的R1R6类型的启动子，遂将该资源确定为红肉资源。只有红勋1号的果芯、果肉和果皮全为血红色，属于比较有特色的红肉苹果资源。表2

表2 供试红肉苹果品种果肉描述Table 2 Description of red meat varieties tested

2.2 红肉苹果资源的数量性状差异

研究表明，不同指标的数量性状的变异幅度在11.66%～57.10%，单果重的变异系数最大为57.10%，最大值是YNX-5的单果重，为124.57 g，和栽培苹果的单果重相差不大，出现最小值是16.57 g，是红勋1号。可溶性固形物的变异系数是11.66%，最大值是17.63%为CB-4，最小值是10.66%为JMS-1。可溶性固形物的指标基本上差异不大。果形指数的平均值为0.91，果实性状大部分属于圆形果，果形指数上未有低于0.8的，ML-1和JMS-1的果形指数等于和大于1为长圆形。苹果资源具有丰富的遗传多样性。表3

表3 供试红肉苹果资源果实数量性状变异Table 3 Variation and diversity of fruit quantitative characters of red meat varieties tested

2.3 DNA质量检测

利用天根的DNA提取试剂盒，对红肉苹果的叶片进行DNA提取，经1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰，浓度和纯度都较高，可用于后续试验。图1

图1 部分DNA电泳图 Fig.1 Partial of DNA electrophoresis

2.4 MYB10启动子类型鉴定

研究表明，所有的样品都为扩增出了2条带，2条条带的大小一致，都在250～500 bp，根据红肉苹果中的MYB10基因启动子类型的试验及研究结果，若为单一的180 bp(300 bp)条带，则为R1型的启动子；若为单一的300 bp(400 bp)的条带，则为R6型启动子。2个条带都有则为 R6R1型启动子。研究中使用的引物1在所用的样品中均扩增出2条条带，大小在250～500 bp，符合R6R1型启动子的判断。图2

注：M:2 000 Marker (2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)，1～29:红肉苹果Note: M:2，000 Marker (2，000 bp，1，000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)，1-29:red fresh apple图2 MYB10-F1R1 29个红肉苹果叶片MYB10启动子基因型鉴定Fig. 2 MYB10-F1R1 Genotype of MYB10 promoter leaves of 29 red fresh apple strains

研究表明，引物2在29个红肉苹果品种(单株)中的扩增结果显示全部均为2条带，所有单株的条带大小一致，都在500～750 bp。依据的MYB10启动子类型的推测。若为单一的750 bp左右大小的条带则为R6型启动子，若为500 bp左右大小的条带则为R1型启动子。若为2条带，则为R6R1型启动子。研究中使用的引物2在所有的样品中均扩增出2条条带，大小在500～750 bp，符合R6R1型启动子的判断。图3

注：M:2 000 Marker (2 000 bp，1 000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)，1～29:红肉苹果Note: M:2，000 Marker (2，000 bp，1 000，bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)， 1-29: red fresh apple图3 MYB10-F2R229个红肉苹果叶片MYB10启动子基因型鉴定Fig. 3 MYB10-F2R2 Genotype of MYB10 promoter leaves of 29 red fresh apple strains

3 讨 论

Espley等提出在红色苹果中MYB10的启动子有R1和R62个类型，而且由于R6启动子高度串联重复极大增加了苹果中的红色，而R1启动子多存在于白肉苹果中，对红色的产生没有影响[14，19]。不同研究者使用不同的引物鉴定了MYB10启动子条带的大小也不一致[17-20]，但均依据条带是否是单一和位置，判定的启动子的类型。结合此次研究使用的的2种引物，引物1的2条条带的大小在250～500 bp，所用样品均无单一条带，符合R6R1型启动子的判断。引物2在所有的样品中均扩增出2条条带，大小在500～750 bp，且所有样品无单一条带出现，符合R6R1型启动子的判断。

通过自行设计的引物和前人的研究结果相比对，利用2对不同的引物对29个红肉苹果品种(单株)进行双重验证，虽然PCR产物序列没有测序，但结果相对可靠。

利用MYB10-F1R1得到的结果条带大小在260～480 bp，全部为2条带，这与前人研究的苹果MYB10启动子结果相吻合，和庞慧等[17]的观赏海棠的鉴定结果条带大小不一致，变色叶类各个品种中分别含有片段大小约300、180 bp 2个类型片段，即R6型和R1型启动子；常色绿叶类品种中只含有片段大小约180 bp类型的启动子，即R1型启动子。而试验的结果，所用引物相同，所得条带大小要大于海棠的MYB10启动子，说明不同品种中的MYB10启动子大小可能存在不一致，有差异。

红肉苹果作为一个特殊的资源类型，成为了近几年苹果领域中的研究热点。在新疆发现的红肉野生苹果在果实的性状上，果实大小的多样性较为丰富，研究中发现29个红肉野生苹果的变异幅度达到了57.10%，单果重由124.57 g到16.57 g，差异之大与笔者在先前研究野苹果果实性状的的数据大有不同[21]；推测红肉苹果可能由人为选择的因素，而人为选择的干预的结果直接的体现就是果实大小，导致了在果实大小上多样性较为丰富。此次测定的其他性状类型均具备一定的多样性，但不如单果重表现的差异明显，结合前人研究的结果，以及此次的收集的资源具备丰富的遗传多样性，不同资源的具体的特性性状有待于后期进一步观察验证。

新疆红肉苹果资源类型，在果肉颜色上，红色多为淡红色分布于果皮下、果芯附近的果肉中，在果肉中的呈色也多为丝状和块状分布，未呈色的果肉多为黄绿色和乳白色；其中红勋一号为果肉全红型。YN-3果肉乳白色未有红色呈现，但启动子鉴定其具备R6R1型启动子。

4 结 论

利用2对引物对新疆的29份红肉苹果的启动子进行PCR鉴定，经过PCR检测，第1对引物的条带大小在250 bp和500 bp，而第2对引物检测条带大小在500 bp到750 bp。2种引物鉴定结果一致，全部为R6R1型启动子。果实在果肉颜色和果实的性状上具有丰富的多样性，特别是在果实大小上变异较大，其余性状指标变异幅度不大。