黔东南道地黄精总黄酮的超声辅助提取工艺研究*

龙杰凤，胡秀虹，周邦华，韦国兰，王 翔，2

(1凯里学院，贵州 凯里 556011；2黔东南民族药综合利用工程技术研究中心，贵州 凯里 556011)

黄精为百合科(Liliaceae)黄精属(PolygonatumMill.)多年生草本植物，其根状茎入药[1]。在第四次全国中药资源普查中发现，贵州黔东南黄精蕴藏量大，野生植物资源丰富，药用价值高，黄精是2015版《中国药典》收录的重点药材[2]，贵州苗族用其根茎主治发热感冒咳嗽，民间药用种类大约有十几种[3]；中医常用黄精降血糖、降血脂、抗炎抗菌、延缓衰老、调节免疫力等[4]。现代研究表明黄精富含黄精多糖、皂苷、黄酮、蒽醌类等药用成分[5-8]，Yu H S等[9]从黄精中分离鉴定了甘草素、新异甘草苷、异甘草素等多种黄酮类成分，何兰香等人[10]用酶法-超声提取黄酮的最佳提取条件：纤维素酶的用量为0.75%，乙醇浓度为40%，液料比为20∶1，超声时间30 min，总黄酮含量为1.595%；虽然贵州黔东南的黄精蕴藏量大且药用历史悠久，但是对该药材药用成分及提取工艺研究尚不充分，黔东南黄精总黄酮的超声提取及含量测定未见相关报道，基于黔东南丰富的黄精野生资源及黄酮的重要作用，对其提取工艺的研究势在必行。本文主要对黔东南黄精中总黄酮的超声提取工艺进行试验探究，选出最佳提取工艺，测定其含量。

1 材料与试剂

1.1 实验材料

实验用黄精药材采集于贵州省黔东南州的镇远县、黄平县、丹寨县、黎平县、雷公山，经贵州中医药大学王波老师鉴定为黄精的根状茎，黄酮对照品芦丁采购于成都华康生物工程有限公司。

1.2 实验试剂与仪器

亚硝酸钠、氯化铝、无水乙醇(重庆川江化学试剂厂)；硝酸铝、氢氧化钠(广东汕头市西陇化工厂)；高速万能粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)；暗箱三用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；紫外-可见光光谱仪2550(日本岛津)；超声仪(深圳市洁盟清洗设备有限公司)；循环水真空泵(上海申光仪器仪表有限公司)。

2 实验方法

2.1 黄精药材的处理

将黄精根状茎洗净切片后，置于恒温干燥箱60 ℃保持24 h除去水分烘干，待冷却后取出，粉碎过40目筛，备用。

2.2 标准品的制备

精密称量芦丁标准品50.0 mg，置于25 mL的容量瓶中，加适量乙醇溶液溶解，室温放冷，再加乙醇定容，摇匀，再精密量取10 mL芦丁溶液至100 mL 的容量瓶中，加水摇匀定容，得到0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液，备用。参照《中国药典》，准确量取芦丁标准品0.0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL置于10 mL的容量瓶中，分别在标签上写上1到6组，每个量瓶中加入0.4 mL 5%亚硝酸钠溶液，混匀，放置6 min后；加入0.4 mL 10%硝酸铝，摇匀，放置6 min，最后加入4 mL 40%氢氧化钠，加水定容至刻度，摇匀，放置15 min。

2.3 样品的提取制备

称定黄精粉末2.0 g置入圆底烧瓶中，加入60%乙醇，料液比1∶10，温度50 ℃ ，保鲜膜封口，超声时间25 min，经冷却、过滤、收集滤液，作为样品溶液。

2.4 黄酮薄层色谱的制备

取硅胶G薄层板在120 ℃活化2 h，冷却待用，黄精提取液为供试液，芦丁标准液为对照液，以V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶1为展开剂，在紫外光灯365 nm下检视。

2.5 紫外波长的选择

以芦丁标准液在紫外分光光度仪(岛津UV-2550)下进行3次光谱测定，均在512 nm处出现最大吸收峰。

2.6 提取工艺设计

用超声辅助提取法，对黄酮提取的影响因素主要有以下4种：提取温度、料液比、体积分数、提取时间，通过单因素实验设计正交实验，考察4种因素的影响。首先实验设定提取溶剂为无水乙醇，提取温度为60 ℃，提取时间为1 h，料液比为1∶10，溶剂体积分数60%，改变其中的某一个因素，固定其他因素。

3 实验结果与分析

3.1 标准曲线、线性关系与薄层色谱

3.1.1 芦丁标准曲线的绘制

以芦丁的吸光度A为纵坐标，浓度(mg/L)为横坐标，绘制芦丁标准曲线(图1)，芦丁标准品各浓度的吸光度测定结果见表1，在512 nm处芦丁标准曲线的回归方程为y=56.686x-0.0018，R2=0.9996。结果表明，在0.002～0.010 mg/mL的范围内，吸光度与总黄酮浓度呈良好的线性关系，见图1。

表1 512nm处芦丁标准品各含量的吸光度测定结果Tab.1 Absorbance determination results ofstandard rutin at 512 nm

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

3.1.2 薄层色谱结果

分别用毛细管蘸取对照品与供试品样品液各10 mL，点样于在120 ℃活化2 h的硅胶G薄层板，点样编号为1至6，其中1、2为对照品，3、4、5、6为供试品，以V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶1为展开剂，展开约至8 cm时取出，用吹风机吹干，喷三氯化铝试液，吹干，在紫外光灯365 nm下检视，可以看见对照品与供试品在相应的位置下显示相同的黄绿色斑点，但供试品黄绿色斑点较淡，说明总黄酮含量较低，其结果见图2。

图2 芦丁薄层色谱图Fig.2 Thin layer chromatogram of rutin

3.2 单因素实验结果与分析

3.2.1 不同料液比对黄精总黄酮提取率的影响

精密称取2.0 g黄精粉末5份，在温度60 ℃、体积分数60%条件下提取15 min，共设置5个分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的料液比，固定其他因素不变，计算总黄酮的含量，结果见表2和图3。

表2 料液比对总黄酮提取率的影响Tab.2 Effect of material liquid ratio on the extractionrate of total flavonoids

图3 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of material liquid ratio on theextraction rate of total flavonoids

3.2.2 不同体积分数对黄精总黄酮提取率的影响

精密称取2.0 g黄精粉末5份，在温度60 ℃、料液比1∶10、提取时间15 min条件下，共设置5个分别为60%、70%、80%、90%、100%的乙醇体积分数，固定其他因素不变，计算总黄酮的提取率，结果见表3和图4。

表3 体积分数对总黄酮提取率的影响Tab.3 Effect of volume fraction on the extractionrate of total flavonoids

图4 体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of volume fraction on the extractionrate of total flavonoids

3.2.3 不同超声提取时间对黄精总黄酮提取率的影响

精密称取2.0 g黄精粉末5份，在温度60 ℃、料液比1∶10、体积分数60%的条件下，分别提取15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，固定其他因素不变。计算总黄酮的提取率，结果见表4和图5。

表4 超声时间对总黄酮提取率的影响Tab.4 Effect of ultrasonic time on the extractionrate of total flavonoids

图5 超声时间对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extractionrate of total flavonoids

3.2.4 不同提取温度对黄精总黄酮提取率的影响

分别精密称取2.0 g黄精粉末5份，在料液比为1∶10、体积分数60%、提取时间15 min条件下，分别设定提取温度为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，固定其他因素不变。计算总黄酮的提取率，结果见表5和图6。

表5 提取温度对总黄酮提取率的影响Tab.5 Effect of extraction temperature on the extractionrate of total flavonoids

图6 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.6 Effect of extraction temperature on theextraction rate of total flavonoids

3.3 黄精总黄酮提取工艺的正交试验

由上述单因素实验结果可知，对每一个实验变量选定3个水平4个因素，进一步探讨在相近的实验条件下更加精准的控制实验变量，以求最佳得率，优选最优工艺，即水平与因素表见表6。

表6 水平与因素表Tab.6 Table of levels and factors

根据上述所设计的因素水平，设计以L9(34)为正交试验方案提取黄精总黄酮，且每组实验都在相同的条件下重复3次提取，操作步骤与单因素实验步骤一样，优选出黄精总黄酮提取工艺的优化条件，其正交实验结果见表7。

表7 L9(34)正交试验结果Tab.7 Results of L9(34) orthogonal test

根据正交试验表R值可知，影响黄精总黄酮提取率的因素强度为：料液比(D)>提取温度(A)>体积分数(C)>提取时间(B)，故以超声波提取黄精总黄酮最佳的提取工艺为A2B2C3D1，即提取温度70 ℃、超声时间45 min、乙醇浓度80%、料液比1∶5，则总黄酮的提取率为1.23%，含量为2.46 mg/g。

3.4 正交试验的验证实验

按照优化得到的提取工艺，进行验证实验。结果显示，验证实验的均值含量均高于正交实验表中的各个实验号，说明提取工艺稳定，重复性好。见表8。

表8 验证实验结果Tab.8 Verification of experimental results

3.5 稳定性实验验

取正交实验A2B2C3D1所得的供试品溶液，分别在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h测定其浓度与吸光度，计算RSD=0.97%，其结果表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。

4 结论与讨论

本实验研究利用超声波法从黄精中提取总黄酮化合物的工艺，考察了提取温度(A)、提取时间(B)、体积分数(C)、料液比(D)4个因素对总黄酮提取率的影响，并通过正交试验得出最佳工艺。结果表明，4个因素对黄精总黄酮得率的影响强度为D>A>C>B，最佳工艺以料液比为1∶5、提取温度为70 ℃、乙醇浓度为80%、提取时间为45 min，此时总黄酮含量为2.46 mg/g。