苗药血人参总黄酮的分离及体外抑菌研究*

傅 建，付慧晓，张永萍▲，李友露，童 玲，杨 姗，吴静澜

(1贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2贵阳市第一人民医院，贵州 贵阳 550002)

苗药血人参为豆科木蓝属植物茸毛木蓝IndigoferastachyoidesLindl.的干燥根，为贵州少数民族地区用药，又以苗族地区使用最为广泛，主要分布在贵州省的六枝特区、盘县、水城、紫云和贵阳等25个地区[1]，云南、广西和湖北等地也有分布[2]。血人参收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，具有滋阴补虚、活血舒筋、调经摄血的功效，主治肝硬化、崩漏、体虚久痢、跌打损伤、肠风下血等症[1]。目前关于血人参的资源调查、化学成分及药理活性评价有研究报道[3-5]。在药效物质基础方面，课题组前期发现血人参中富含大量的黄酮类化合物[6-7]，但是目前血人参黄酮类化合物的活性研究较少[8]，且在抑菌方面笔者未见国内(外)文献报道。黄酮类化合物素来在抑菌作用方面都表现出良好的开发潜力，已经成为近年来研究的热点之一[9-10]。一些学者从植物中分离得到的黄酮提取物具有很强的抑菌活性，最低抑菌浓度(MIC)已达到0.25 μg·mL-1，有望成为抗菌药物的先导化合物[11]。本实验采用硅胶、聚酰胺柱层析法富集得到含量较高的血人参总黄酮，并对其进行了体外抑菌活性研究，以期为该药用资源的充分、合理开发提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 药材及其对照品

血人参药材由贵阳德昌祥药业提供，并鉴定为豆科木兰属植物茸毛木蓝IndigoferastachyoidesLindl.的根；环丙沙星(含量98%，萨思化学技术有限公司)；芦丁(含量92%，中国药品生物制品检定所)；表儿茶素(含量93%，中国药品生物制品检定所)。

1.2 试剂

营养琼脂、氯化钠、酵母膏、胰蛋白(杭州微生物试剂有限公司)；硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠均为分析纯(上海泰坦科技股份有限公司)；滤纸片(通用电气生物科技有限公司)。

1.3 菌株

大肠杆菌(Escheriechiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念球菌(Candidaalbicans)均为贵州省中国科学院天然产物重点实验室提供。

1.4 主要仪器设备

YJ13/2B-G型密闭二连体煎药机(北京东华原医疗设备有限责任公司)；RE-5210A型旋转蒸发仪(上海亚荣仪器有限公司)；TDL-5A型离心机(湖南星科科学仪器公司)；UV-5900紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；移液器(德国Eppendorf公司)；LDZX-50KBS立体压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；HZQ-F160A恒温振荡器(上海一恒仪器有限公司)。

2 方法

2.1 血人参提取物的制备

称取9 kg血人参药材干燥根经粉碎成粗粉(过40目筛)，充分浸渍后，依次用90%、60%乙醇在79 ℃下分别高压煎煮2次，每次2 h，合并滤液，于60 ℃旋转蒸发溶剂，加入两倍体积的水分散，离心，药渣经旋转蒸发溶剂，真空干燥，备用。

2.2 血人参中总黄酮含量测定[8]

2.2.1 线性关系考察

称取芦丁对照品4.43 mg，加60%甲醇溶解定容至25 mL量瓶中，摇匀，制成0.2953 g·L-1溶液。精密吸取对照品溶液1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL，置于25 mL具塞比色管中，加入60%甲醇至6 mL，摇匀，加入5%NaNO2溶液1 mL，摇匀，静置6 min，再加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，静置6 min，最后加入4%NaOH溶液10 mL，60%甲醇定容至刻度，摇匀，静置15 min，以60%甲醇为空白，在510 nm波长处测定吸光度。以含有量为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)进行回归，得回归方程为Y=5.6568X-0.0062 (R2=0.9994)，线性关系良好。

2.2.2 含量测定方法

取待测组分适量，精密称定，加入60%甲醇定容至5 mL，摇匀，吸取1 mL置于25 mL具塞比色管中，按“2.2.1”项下方法加入显色剂，以60%甲醇和显色剂为空白，测定吸光度，计算总黄酮含量。

2.3 纯度测定

参照邵金华等[12]的方法，将总黄酮粗提物、硅胶洗脱组分及纯化后的黄酮均配成1 g·L-1溶液，按“2.2.2”项下方法测定吸光度，计算纯度。

2.4 硅胶柱层析分离血人参总黄酮

称取500 g血人参总黄酮提取物用适量乙醇溶解，拌入500 g硅胶，挥去溶剂后上样于处理好的层析柱，用洗脱剂二氯甲烷-甲醇(100∶10，100∶25，100∶50，100∶100，0∶100)梯度洗脱，每50 mL收集一份，以表儿茶素作对照品，经薄层层析(TLC)检测洗脱液，合并相似组分，旋转蒸发溶剂，真空烘干，得到血人参不同极性的总黄酮组分6份，测定其中总黄酮含量，计算纯度，记为SC-1～SC-6，备用。

2.5 聚酰胺柱层析富集血人参总黄酮

对于抑菌活性较好的硅胶洗脱组分，再上样于聚酰胺柱层析柱纯化。称取SC-1组分适量，用乙醇溶解稀释成质量浓度2.80 g·L-1(按浸膏量计)，作为上柱样品溶液。上柱样品溶液拌入2 g干燥聚酰胺粉末，挥去溶剂后上样于处理好的层析柱，依次用蒸馏水和体积分数50%、60%、70%、80%的乙醇洗脱，收集各部分洗脱液，测定总黄酮含量，合并含总黄酮高的洗脱液，旋转蒸发溶剂，即得到较高纯度总黄酮，测定总黄酮含量，计算纯度，备用。

2.6 血人参总黄酮抑菌活性的测定[13]

2.6.1 培养基的配制

LB固体培养基：NaCl 5.0 g，酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂粉20.0 g，去离子水定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min；LB液体培养基：NaCl 10.0 g，酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0 g，去离子水定容至1000 mL，121 ℃灭菌20 min。

2.6.2 菌悬液及滤纸圆片制备

每次实验前预先对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌4种供试菌进行活化，用接种环分别挑取一环活化后的菌种，接种到10 mL灭菌营养琼脂液体培养基的锥形瓶中，于37 ℃恒温振荡培养箱中培养10 h后作为原菌液。采用比浊法用0.5麦氏比浊管对比配制菌体悬浮液，用灭菌生理盐水将各原菌液稀释，配制菌体悬液的菌数1×107～1×108cfu/mL，备用。用打孔器打出直径为6 mm的滤纸小圆片121 ℃灭菌15 min后烘干，备用。

2.6.3 血人参总黄酮抑菌活性测定

采用K-B纸片扩散法。在无菌条件下将“2.4”项下不同组分用无菌二甲基亚砜溶液(DMSO)溶解，配制成高低总黄酮浓度分别为10.0 g·L-1、5.0 g·L-1的供试样品。另设有环丙沙星(0.1 g·L-1)和10%DMSO溶液作对照，将滤纸片置于上述溶液浸泡10 h。将灭菌后的培养基倾入无菌培养皿凝固后，吸取0.1 mL的3种供试菌悬液于培养基平板上，用涂布棒涂布均匀。用无菌镊子夹取出浸泡过的滤纸圆片，沥干，均匀置于培养基表面，每个培养皿均匀放置6片滤纸，编号标记，将含细菌的培养皿置于37 ℃条件下培养24 h，含有真菌的培养皿置于28 ℃条件下培养48 h，观察滤纸圆片周围是否出现抑菌圈，十字交叉法量取抑菌圈直径，每组试验平行3次，求平均值。

2.6.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定

采用平板二倍稀释法。将抑菌活性较好的组分SC-1及其富集黄酮后的组分，分别配制0.3125～5 g·L-16个浓度梯度，吸取各浓度的溶液1 mL置于培养皿内，注入50 ℃无菌培养基后充分混匀，待培养基凝固后，分别滴加4种供试菌的菌悬液各0.1 mL，用涂布棒涂布均匀，对含细菌培养皿进行培养。将完全无菌生长的平板所对应的浓度记为最低抑菌浓度，每组试验平行测定3次，求平均值。

2.7 数据处理

SPSS 17.0对数据进行处理分析，测定结果用平均值±标准差的形式表示。

3 结果与分析

3.1 不同总黄酮浓度的抑菌圈直径测定结果

采用硅胶柱层析二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，所得黄酮组分极性逐渐增加，对其配制了高低总黄酮浓度(10.0g·L-1、5.0 g·L-1)进行了抑菌活性测定。由表1可知，对于产生抑菌效果的各受试菌株，供试组分总黄酮浓度增加，抑菌圈直径亦增加；随着供试组分的黄酮极性的增加，其抑菌活性反之逐渐降低或无抑菌活性。

上述6种组分对枯草芽孢杆菌无抑菌效果。SC-1和SC-2仅在高浓度下对白色念珠菌表现低敏。各组分对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑菌活性，总体上对金黄色葡萄球菌的抑菌活性强于大肠杆菌。对于大肠杆菌，SC-1抑菌活性最佳，为中敏；相同浓度下的SC-2与SC-3抑菌活性接近稍强于SC-4，均为低敏；SC-5在高浓度下才具有抑菌活性，SC-6组分几乎无抑菌活性。对于金黄色葡萄球菌，SC-1在低浓度条件下为中敏，但在高浓度条件下表现为高敏；相同浓度下的SC-2～SC-4抑菌活性逐渐减弱，高、低浓度下分别表现为中敏和低敏；SC-5在高低浓度均为低敏，强于SC-6，其在高浓度下为低敏。由此可知，血人参总黄酮具有抑菌活性，在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌活性基本均以组分SC-1的效果最佳，因此进一步采用聚酰胺富集总黄酮。

3.2 纯度测定结果

用聚酰胺层析柱对抑菌活性较好的SC-1进行总黄酮富集，富集前黄酮纯度仅为(17.8±0.2)%，富集后达到(64.2±0.3)%，提高了3.6倍，表明聚酰胺对黄酮的富集效果良好。

3.3 最低抑菌浓度(MIC)测定结果

对富集前的组分SC-1和富集后的组分进行MIC测定。由表2结果可知，富集前黄酮对3种供试菌的MIC由高到低依次是：白色念珠菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，富集后的黄酮MIC降低趋势更加明显，两者对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌效果更好，MIC分别达0.625 g·L-1、0.3125 g·L-1。

表1 硅胶柱层析不同极性组分的抑菌圈直径(x±s，n=3)Tab.1 Bacteriostatic circle diameter of each component bysilica gel column chromatography

表2 血人参总黄酮的MIC测定Tab.2 Determination of MIC of total flavonoids of Indigofera stachyoides

4 结论

本文采用硅胶以不同比例二氯甲烷-甲醇洗脱，有效地分离出6种黄酮类组分SC-1～SC-6，K-B纸片法分别比较了总黄酮浓度为5.0g·L-1、10.0 g·L-1的组分对革兰氏阴性菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)、革兰氏阳性杆菌金黄色葡萄球菌及真菌白色念珠菌的抑菌活性。实验结果表明，枯草芽孢杆菌均对上述供试组分无抑菌活性，白色念珠菌对SC-1～SC-2组分低度敏感，其余受试菌均表现一定抑菌活性。实验过程中还发现，血人参黄酮中极性较小的组分，抑菌活性较强，与罗晓韵等[14]对水辣蓼总黄酮不同极性部位抑菌活性研究的结果相一致，说明血人参总黄酮抑菌活性成分集中在极性较小的部位；相较于低浓度黄酮而言，高浓度的黄酮的抑菌圈直径均有明显增加，总黄酮浓度与抑菌活性呈正相关，表明总黄酮浓度也是影响抑菌效果的重要因素之一[15]。进一步用聚酰胺对所得高抑菌活性的黄酮组分进行富集，结果显示总黄酮纯度由17.8%提高到64.2%，显示聚酰胺树脂纯化血人参总黄酮效果良好。对4种受试菌株采用平板二倍稀释法，将富集前后的黄酮组分的MIC进行比对发现，与其纯度呈正相关，表明提高血人参黄酮纯度可以增强抑菌活性；对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌有更明显的抑制作用，与革兰氏阳、阴性菌的抑菌活性强弱并无一致，这可能与植物来源和黄酮结构有关[16-17]。

以上研究结果证实血人参中富含的黄酮类化合物是其潜在抑菌活性成分。鉴于此，后续实验可利用植化手段并对血人参化合物进行结构鉴定和组分分析，进一步明确血人参中抑菌的主要活性成分，并探究其作用机制。