葡萄糖氧化酶协同抗生素抑菌效果的研究

2020-12-30作者荆新堂于东陈宁波芮法祥杜正超

广东饲料 2020年11期

◆作者：荆新堂于东陈宁波芮法祥杜正超

促生长抗生素（AGP）是一类对致病菌、寄生虫等具有抑制和杀灭作用的药物添加剂，被广泛应用于饲料生产和养殖业中，在提高饲料转化率、促进畜禽生长方面发挥了重要的作用。在实际生产中，由于AGP的长期使用，养殖环境中致病菌的耐药性不断增强，各种混合感染导致的动物病死率逐年上升，给养殖户造成了极大的经济损失。由于常规治疗用抗生素使用量越来越大，食品中抗生素残留出现的概率越来越高，寻找AGP的替代品成为畜牧行业关注的焦点，低抗或无抗养殖成为当前畜牧业发展的一大趋势。

葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase，GOX）是一种以FAD为辅基的黄素蛋白酶（图1），能够利用分子氧作为电子受体，催化β-D-葡萄糖氧化生成D-葡萄糖酸和过氧化氢（图2）。作为一种绿色安全的添加剂，在化工、制药、食品、饮料、临床化学、生物技术等行业得到广泛应用。而在饲料添加剂领域，葡萄糖氧化酶以其无毒、无耐药性、无残留的特点，成为近几年来继酸化剂、益生菌、植物提取物等之后的又一研究热点。

图1 葡萄糖氧化酶带状分子结构

图2 葡萄糖氧化酶的作用机理

当前，葡萄糖氧化酶的研究报道主要集中于酶活检测和养殖端的应用效果验证上，对联合抗生素进行抑菌、减少抗生素的使用方面的研究较少，本试验从体外抑菌的角度，研究葡萄糖氧化酶、抗生素、葡萄糖三种组分在何种浓度下，对致病菌的抑制效果最好，以期为葡萄糖氧化酶在养殖生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水溶性葡萄糖氧化酶：酶活1000 U/g，济南百斯杰生物工程有限公司；大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌，广东环凯微生物科技有限公司；替米考星、硫酸粘杆菌素、安普霉素、痢菌净，济南禽牧帮生物技术有限公司。

1.2 试验设计

本试验采用牛津杯法（管碟法）对致病菌进行抑菌圈的测定，采用液体培养鉴定OD600值的方法对致病菌进行抑菌率的测定。

1.2.1 试验一：GOX对致病菌的抑制试验

配制浓度分别为200mg/L、300 mg/L、600mg/L的GOX溶液（含1%葡萄糖）待用。采用双层平板进行致病菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌）菌液的涂布，即在无菌培养皿中倒入15 mL LB琼脂培养基封底，凝固后取0.4 mL浓度为108 CFU/mL菌液加入到100 mL LB琼脂培养基（55～60℃）中混匀，后取6 mL加入到LB平板中。待平板凝固后，在培养基表面放置一个牛津杯，分别加入200μL的GOX溶液，37℃培养24 h，测定抑菌圈大小。

1.2.2 试验二：抗生素+GOX在LB琼脂培养基中的抑菌试验（测抑菌圈）

配制100 mg/L的抗生素（替米考星、硫酸粘杆菌素、安普霉素、痢菌净）水溶液（含1%葡萄糖），分对照组和试验组。对照组加蒸馏水，试验组加GOX，分别制成试验样液待用。采用双层平板进行致病菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）液的涂布（操作同试验一），待平板凝固后，在培养基表面放置一个牛津杯，分别加入200μL的试验样液，37℃培养24 h，测定抑菌圈大小。

1.2.3 试验三：抗生素+GOX在LB液体培养基中的抑菌试验（测OD600值）

将菌液（金黄色葡萄球菌）稀释到106CFU/mL待用。试验分对照组和试验组1、2、3，取离心管分别加入菌液、抗生素（100 ppm替米考星）、GOX、葡萄糖（见表1），其中试验组1、2、3中的GOX又分为9个浓度梯度（0.1 U/mL～0.9 U/mL），再加入LB液体培养基，最后将每个管内溶液的体积用蒸馏水补至相同。37℃，200 rpm恒温摇床培养，24 h后测溶液的OD600值，计算抑菌率。

抑菌率（%）=（阳性对照-试验）/（阳性对照-阴性对照）×100

1.2.4 试验四：抗生素+GOX抑菌试验中GOX和葡萄糖添加量的优化试验

首先配制浓度为100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L的GOX溶液，再将每个浓度的GOX溶液中分别添加1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.1%、0.0625%的葡萄糖溶液，最后在每个溶液中添加一定量的抗生素（替米考星），使抗生素的终浓度为100mg/L，进行致病菌（大肠杆菌）的培养，37℃，200 rpm恒温摇床培养，24 h后测溶液的OD值，计算抑菌率。

2 结果

2.1 GOX对致病菌的抑制试验

在溶液中有葡萄糖存在的情况下，添加不同剂量的GOX，均可以抑制致病菌的生长。对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌三种致病菌的作用结果相同，即GOX的浓度越高，抑菌圈的直径呈现出越大的趋势（表2）。

表2 不同剂量GOX对肠道致病菌的抑菌效果

2.2 抗生素+GOX在LB琼脂培养基中的抑菌试验

抑制金黄色葡萄球菌的试验：与对照组相比，抗生素为替米考星时，抑菌圈面积提高23%；抗生素为硫酸粘杆菌素时，抑菌圈面积提高40%；抑制大肠杆菌的试验：与对照组相比，抗生素为安普霉素时，抑菌圈面积提高32%；抗生素为痢菌净时，抑菌圈面积提高27%（表3）。

表3 GOX对抗生素的协抗作用

2.3 抗生素+GOX在LB液体培养基中的抑菌试验

在同一试验组中，GOX浓度介于0.1～0.9 U/mL时，各个试验组抑菌效果相差不大，基本维持在97%～98%；在不同的试验组中，与对照组相比，各试验组在添加GOX之后，均体现出较好的抑菌效果，抑菌率比对照组提高了6.5%～8.0%，其中，以GOX+葡萄糖+替米考星的组合抑菌效果最好（图3）。

2.4 抗生素+GOX抑菌试验中GOX和葡萄糖添加量的优化试验

在抗生素（100mg/L替米考星）固定的条件下，随着葡萄糖添加量的降低，GOX+抗生素抑菌效果有所下降，但降幅较小，从优化试验的角度考虑，当葡萄糖添加量为0.1%时，GOX仍然能够发挥良好的抑菌效果。

随着GOX浓度的降低，协抗抑菌作用有所下降，但降幅较小。当GOX的浓度最小为50 mg/L时，仍有比较明显的协抗抑菌效果（图4）。

3 讨论

3.1 GOX对致病菌的抑制作用

GOX是一种比较特殊的酶制剂，它不同于我们理解中的消化酶、非淀粉多糖酶。它的作用机理是通过葡萄糖的氧化消耗氧气，同时产生葡萄糖酸和过氧化氢。肠道中氧气减少，创造有利于有益微生物生长繁殖的无氧条件；过氧化氢虽不稳定，但抗微生物起作用的浓度极低。有试验表明，大肠杆菌培养时给予恒定浓度的过氧化氢（浓度0.02～0.05 mmol/L）时，大肠杆菌生长即受抑制，该浓度不伤害人皮肤的成纤细胞，也远远低于现行过氧化氢消毒液。本试验中单独添加GOX即能产生良好的抑菌效果，是由于GOX催化反应过程中产生过氧化氢，而且过氧化氢不断累积所致。GOX浓度越大，累积的过氧化氢越多，抑制效果越好，这与汤海鸥等（2015）的研究结果相一致。而在动物肠道中，过氧化氢不会产生累积效果，更多的是从改善肠道微生物生长环境入手，不会使致病菌产生耐药性，不会产生残留，更不会对动物产生副作用，是名副其实的绿色安全健康产品。

图3 不同试验组的抑菌率对比

图4 不同浓度葡萄糖及GOX的抑菌率对比

3.2 抗生素+GOX联合使用对致病菌的抑制作用

由于饲用促生长抗生素的长期使用，养殖环境中致病菌的耐药性越来越强，治疗用抗生素的使用效果越来越差，寻找一种抗生素的替代物或增强剂来缓解致病菌耐药性的问题迫在眉睫。试验二和试验三从固态和液态两个角度分别进行抑菌圈和OD值的测定，试验所用致病菌包括金黄色葡萄糖菌（G+）和大肠杆菌（G-）两种；所用的抗生素既有饲料禁抗前长期在饲料中使用的硫酸粘杆菌素，又有养殖终端常用的替米考星、痢菌净、安普霉素，整个试验涉及范围广，代表性强，全面验证了GOX在各种条件下的作用效果。GOX既可以作为一种抗生素抑菌增强剂，也可以单独长期使用，从不同的方位和角度维持动物肠道健康，从而达到替抗、减抗、无抗的目的，是一种绿色、环保、无残留、无害的饲料添加剂。

3.3 GOX和葡萄糖添加量的优化试验

作为一种特殊的功能性添加剂，GOX作用的发挥依赖于葡萄糖的存在，葡萄糖添加量的大小直接影响到GOX抑菌功能的发挥。由于肠道是淀粉消化的主要场所，葡萄糖的含量较高，GOX与饲料一同饲喂动物，可不考虑肠道中葡萄糖含量不足的问题。但在体外试验中，葡萄糖的多少对于试验的成败至关重要。试验三中的试验组1（替米考星+GOX）虽然未加葡萄糖，与对照组相比，抑菌率达到97%以上，是由于抗生素载体中含有部分葡萄糖（掩盖替米考星的苦味）所致。本试验通过对GOX和葡萄糖添加量的优化，既验证了葡萄糖在GOX协抗作用中的重要性，也验证了GOX协抗抑菌的最小添加量，为GOX在实际生产中进行应用提供了指导。