食管上皮性病变真菌检测的临床价值

陈 玉，周 强

消化系统肿瘤是人类常见的疾病之一，随着工业化进程和人们生活水平的提高及饮食结构的改变，其整体发病率呈年轻化且有上升趋势，但其病变特点、发生和发展机制尚不清楚[1]。食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤，病死率高，可分为鳞状细胞癌及腺癌两种病理类型，我国约90%食管癌患者为食管鳞状细胞癌，其发生是一个多因素、多步骤的生物学过程。目前，食管癌的主要病因有遗传易感因素、化学类亚硝胺物质、缺乏某些微量元素、烟酒、热食、热饮、口腔不洁以及生物性病因，如真菌感染，其中真菌是主要因素。目前，真菌在食管上皮性病变中的检出率报道较少，六胺银染色主要对组织中的真菌着色。本文采用HE和六铵银染色检测食管病变组织中真菌的阳性率，探讨真菌检测在食管上皮性病变中的临床价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2018年9月～2019年3月南京大学医学院附属鼓楼医院病理科食管鳞状上皮性病变125例，其中低度上皮内瘤变30例、高度上皮内瘤变30例、鳞状细胞癌35例、慢性食管炎伴鳞状上皮增生30例。患者男性74例，女性51例，年龄40～74岁，平均(58.3±4.8)岁。本实验经我院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 方法(1)HE染色：每个病例选取1张白片进行HE染色，使用DAKO全自动染色机染色；显微镜高倍视野观察有无真菌。(2)六铵银染色：每个病例选取1张黏附载玻片捞片的白片，60 ℃烘箱，烤片30 min，二甲苯脱蜡3次，无水乙醇脱二甲苯3次，流水冲洗数秒，置入铬酸氧化10 min，胺银染液70 ℃浸染60 min，镜下观察染色程度至标本转变成黄褐色，流水冲洗数秒，0.1%氯化金调色1～2 min，流水冲洗数秒，伊红复染10 s，流水冲洗，DAKO全自动染色机选择封片程序封固。镜下1 000倍视野观察。

1.3 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同染色方法在食管上皮性病变的真菌检出率HE染色在慢性食管炎伴鳞状上皮增生和低度上皮内瘤变真菌检出率均为0(图1)，在高度上皮内瘤变和鳞状细胞癌中的检出率较高分别为6.7%和14.3%(图2、3)。六铵银染色法在慢性食管炎伴鳞状上皮增生中为0，在低度上皮内瘤变中为30%(图4)，高度上皮内瘤变的检出率为33.3%(图5)，鳞状细胞癌中检出率60%(图6)。在高度上皮内瘤变及鳞状细胞癌中，HE及六铵银染色在诊断真菌检出率差异有统计学意义(χ2=6.67，P<0.05；χ2=17.35，P<0.05，表1)。

图1 食管低度上皮内瘤变未见真菌附着，HE染色 图2 食管高度上皮内瘤变见真菌附着，HE染色 图3 食管鳞状细胞癌见真菌附着，HE染色 图4 食管低度上皮内瘤变表面未见真菌附着，表面脱落的正常上皮碎片可能在六铵银染色下误诊为真菌，六铵银染色 图5 食管高度上皮内瘤变表面见真菌附着，六铵银染色 图6 食管鳞状细胞癌表面见真菌附着，六铵银染色

表1 不同染色在食管上皮性病变中的真菌检出率

2.2 HE联合六铵银染色在食管上皮性病变中的真菌检出率HE联合六铵银染色在不同食管上皮性病变中真菌检出率不同，在慢性食管炎伴鳞状上皮增生和低度上皮内瘤变中的检出率为0和16.7%，在高度上皮内瘤变和鳞状细胞癌中的检出率为36.7%和57.1%，随着食管上皮性病变恶性程度增生，真菌检出率有提高，差异有统计学意义(χ2=35.95，P<0.05，表1)。

3 讨论

目前，上消化道肿瘤与微生物菌群的分析还处于起步阶段，多项流行病学研究均提示上消化道肿瘤与微生物菌群密切相关[2-4]。癌前病变的特征性菌群可为肿瘤的早诊断、早治疗提供新的理论依据，具有潜在的应用前景。识别上消化道癌的标志性菌群不仅可以通过改变菌群组成来治疗疾病，也可用于肿瘤预后复发评估及预警，进一步探讨微生物菌群在肿瘤发生、发展中的作用及机制，是上消化道肿瘤预防领域的研究方向[5]。

组织中真菌检测采用HE染色一般着色不佳，只有当真菌数量较多时HE染色法才可鉴别。六铵银染色可用于组织切片中真菌的检测，与HE和PAS染色相比，其更适合真菌感染检测，特别是在仅有少量有机体的情况下。本实验在鳞状细胞癌中单纯采用HE染色辨别真菌阳性率仅有14.3%，联合六铵银进行判断阳性率提升至57.1%，表明六铵银染色在真菌的诊断及鉴别诊断具有重要意义。

本组中不同级别的食管上皮性病变中，真菌的检出率随着疾病组织学类型的改变而逐渐升高，提示真菌在不同阶段食管上皮性病变的发生、发展中可能发挥重要作用。我国对食管癌高发区研究表明，癌前病变或早期食管癌患者的食管上皮中存在真菌感染，其中念珠菌属真菌是最常见的真菌类型[6]。Hsia等[7]报道白色念珠菌能够增强食道特异性致癌物苄基甲基亚硝胺-亚硝酸盐形成，从而诱导肿瘤发生。以上证据表明，真菌在食管癌发生中发挥重要作用，并成为肿瘤微环境研究热点。食管癌中真菌检出率增强可能与肿瘤局部免疫微环境受到破坏、菌群失调引起真菌定植相关，但有关真菌在食管肿瘤发生及影响肿瘤微环境中的菌体作用研究尚缺乏，需要进一步分析。

特殊染色是病理诊断的辅助技术，虽然没有免疫组化的敏感性和特异性高，但对某些疾病的病理诊断发挥重要作用。现阶段特殊染色试剂盒和全自动仪器还未普及，特殊染色操作多由手工完成，试剂也多需自配，导致结果稳定性较差。因此在特殊染色操作中，应采用外部阳性对照，尤其是六铵银和抗酸染色，以防漏诊。另外，六铵银染色虽然在日常诊断中敏感性高，但特异性低，在真菌检出方面可能与正常杂菌或脱落的上皮碎片混淆，仍需联合HE进一步诊断。在病理技术方面，HE及免疫组化染色均通过全自动化设备(如全自动HE染色机及全自动免疫组化染色机)实现标准化操作，成为病理质量控制的可靠工具，为病理实验室的国际标准化发展接轨也起重要作用，因此特殊染色的全自动操作是病理技术发展的必然趋势。如果能采用全自动特殊染色技术，可为检测结果的准确性进一步提供保证，使病理技术操作具有规范化和稳定性[8]。

综上所述，采用不同染色方法在食管上皮性病变中真菌检出阳性率不同，其与食管上皮性病变级别增加相关，六铵银联合HE染色对食管真菌的检出准确率的提高具有重要意义。