表面活性剂双水相萃取牛血清白蛋白的影响因素

2020-12-30王新刚杨效益孙永强郭朝华李建波

印染助剂 2020年12期

王新刚，杨效益，孙永强，郭朝华，李萍，李建波

（中国日用化学工业研究院有限公司，山西太原 030001）

蛋白质是由氨基酸组成的生物分子，在许多生物工程方面起着至关重要的作用，例如在生物技术方面，蛋白质在治疗和诊断应用中具有重要价值［1］。蛋白质的功能取决于结构的稳定性，但是有聚合物、盐或者有机溶剂存在时［2-5］，或者在高温高压操作条件下［6-7］，又或者是在调节pH的过程［8］中，蛋白质容易失去稳定性而导致功能丧失。因此，开发低成本、可持续而且可以保证蛋白质不变性的分离技术具有重要意义。蛋白质分离的常用技术包括沉淀、过滤、基于反胶束的分离、凝胶色谱、电泳等［9-10］，但是这些传统方法往往存在操作步骤繁琐、蛋白质产率低、需要大量有机溶剂等问题，致使不能实现蛋白质分离的规模化。

高分子水溶液在合适条件（如加盐）下会发生相分离，形成的相分离体系被称为双水相体系（ASTP）。蛋白质等生物分子可以在平衡的两相中都保持活性，但是在利用高分子双水相体系萃取分离蛋白质时却难以实现高分子的回收利用［11］，导致经济成本较高。近年来，有相关研究报道，当阴阳离子表面活性剂在合适的浓度或以合适的比例混合时也会形成双水相体系，并且可应用于蛋白质的萃取。与其他蛋白质分离工艺相比，阴阳离子表面活性剂形成的双水相体系因温度温和、易于操作［12-13］、经济、环境友好，被广泛应用于蛋白质的分离和提取。

在探究窄分布脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠（NAEnS，n=3，5，7，9）与阳离子表面活性十四烷基三甲基溴化铵（TTAB）复配体系的表面行为时发现，聚氧乙烯基团（EO）加合数为5的窄分布脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠（N-AE5S）与TTAB在复配过程中会形成双水相体系。故本实验探究了N-AE5S/TTAB双水相体系中阴阳离子表面活性剂物质的量比、表面活性剂浓度对牛血清白蛋白（BSA）萃取率的影响，同时对萃取机理进行了初步研究。

1 实验

1.1 试剂

窄分布脂肪醇醚硫酸钠（烷基链长C12～14，实验室自制），十四烷基三甲基溴化铵（分析纯）、牛血清白蛋白Ⅴ（98%）（阿拉丁化学试剂公司），实验用水均为去离子水。

1.2 仪器

UV-1601紫外-可见分光光度仪（中国北分瑞利分析仪器有限公司），JEM-1011透射电子显微镜（日本JEOL公司），Zetasizer Nano-ZS90粒度电位仪（英国Malvern公司）。

1.3 标准曲线的绘制

配制不同质量浓度的BSA溶液，利用紫外-可见分光光度仪分别测定278 nm处的吸光度（以水为参比），并根据相应质量浓度下的吸光度绘制标准曲线。

1.4 测试

1.4.1 萃取率

配制N-AE5S/TTAB混合溶液（其中BSA质量浓度固定在1 mg/mL），于25 ℃下静置72 h。同时为了避免其他因素的干扰，在相同条件下做空白实验。待分层稳定后将萃取液和空白样上层表面活性剂富集相稀释50倍，以空白样为参比测试在278 nm处的吸光度。根据下式计算萃取率：

其中，Vu和ρu分别是双水相上层表面活性剂富集相的体积和BSA质量浓度，V和ρ分别是萃取体系的总体积和BSA质量浓度。

1.4.2 Zeta电位

配制0.1 mol/L N-AE5S/TTAB混合溶液，于25 ℃下静置72 h，待分层稳定后利用粒度电位仪测定其上层表面活性剂富集相的电势。

1.4.3 聚集形貌

将N-AE5S/TTAB溶液（物质的量比4.2∶5.8）快速混匀后，于25 ℃下静置72 h，待分层稳定后取上层表面活性剂富集相，利用磷钨酸进行负染色，24 h后利用透射电子显微镜观察。

2 结果与讨论

2.1 双水相区域的确定

将0.1 mol/L N-AE5S溶液与TTAB溶液按照不同物质的量比混合配成总浓度为0.1 mol/L的混合溶液，快速混匀后于25 ℃下静置72 h，待分层稳定后采用逐滴加水法确定N-AE5S/TTAB混合溶液双水相形成的区域，结果如图1所示。

图1 N-AE5S/TTAB混合溶液在25 ℃下的相图

由图1可以看出，N-AE5S/TTAB混合溶液在物质的量比为3.8∶6.2～5.5∶4.5时均能形成ASTP，而且ASTP主要集中于阴离子表面活性剂N-AE5S过量区，只有一小部分存在于较高混合溶液浓度的阳离子表面活性剂TTAB过量区。同时，当N-AE5S/TTAB物质的量比为4.4∶5.6时，将混合溶液稀释至7.79×10-3mol/L仍然能够形成ASTP。

2.2 标准曲线的绘制

如图2a所示，BSA在278 nm处存在较强的吸收峰，故将波长固定在278 nm，测定不同质量浓度BSA溶液的吸光度，然后根据测定结果绘制标准曲线，结果如图2b所示。

图2 0.6 mg/mL BSA溶液的紫外光谱图(a)和标准曲线(b)

2.3 N-AE5S/TTAB双水相体系对BSA萃取率的影响

2.3.1 表面活性剂浓度

如图3所示，随着表面活性剂混合溶液总浓度的增大，萃取率逐渐降低。Asenjo等［14］指出，随着萃取剂分子质量的增大，萃取率逐渐降低。

图3 N-AE5S/TTAB混合溶液浓度-萃取率关系图

如图4所示，随着浓度的增大，ASTP上层表面活性剂富集相中的聚集体从球形聚集体转变为交联在一起且体积较大的网状聚集结构。N-AE5S/TTAB混合溶液聚集体间的进一步聚集致使分子质量增大，萃取率逐渐降低。

图4 N-AE5S/TTAB混合溶液上层表面活性剂富集相的聚集形貌

2.3.2 N-AE5S/TTAB物质的量比

如图5所示，随着N-AE5S在混合溶液中所占比例逐渐增大，萃取率逐渐降低直至为0%。当表面活性剂浓度为6.0×10-2mol/L、物质的量比为4.2∶5.8时，N-AE5S/TTAB混合溶液形成的ASTP对BSA的萃取率达66.05%。与传统蛋白质萃取工艺相比，该萃取体系中水的质量分数为97%，可以减少萃取溶剂的使用量，降低了萃取成本。

图5 N-AE5S/TTAB物质的量比-萃取率关系图

随着N-AE5S在混合溶液中所占比例的增大，混合溶液上层表面活性剂富集相的电势逐渐降低，并从正值转变为负值。而BSA的等电点为4.7［15］，萃取体系的pH为7，所以BSA在N-AE5S/TTAB混合溶液中显负电性。结合图6可知，在N-AE5S/TTAB混合溶液中形成的聚集体通过静电相互作用与BSA结合在一起，而随着N-AE5S在混合溶液中所占比例的逐渐增大，聚集体的正电性减弱，其与BSA间的静电相互作用减弱，导致N-AE5S/TTAB混合溶液对BSA的萃取率逐渐降低。