E-cadherin启动子的荧光示踪体系的建立及验证

谭拥军，吴东丽，余雳，陈燕

（湖南大学生物学院，湖南长沙 410082）

上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal transition，EMT），是指上皮细胞程序性、可逆的转化为间质细胞的过程，根据EMT 发生的特定生物学环境将其分为1 型、2 型和3 型[1].其中，1 型主要与胚胎发育和器官形成相关；2 型主要与组织再生和伤口愈合相关[2]；3 型主要参与上皮细胞的恶性转化[3].三种EMT 类型共同的细胞学机制包括有细胞形态改变、极性丧失、粘附性下降、细胞迁移能力和侵袭能力的增加[4].细胞的EMT 进程除了可以受到TGF-β、Notch 和Wnt 的信号通路调控之外，也可以受到肿瘤微环境（如缺氧）的影响以及microRNA（miRNA）的差异表达的影响[5].对于肺癌来说，EMT 是恶性转化的起始，其中有许多标志物和转录因子的参与，主要表现为上皮标志物如E-cadherin 的表达缺失及一些间质标志物如N-cadherin、vimentin 的表达上升[6].

E-cadherin 是钙离子依赖性的细胞表面蛋白，属于跨膜糖蛋白的一种，主要功能是参与细胞与细胞之间的紧密连接，促进上皮细胞之间的粘附[7].研究表明，E-cadherin 表达下调或缺失与EMT 密切相关，E-cadherin 表达的缺失被认为是肿瘤细胞EMT发生的关键步骤，其下调会导致肿瘤细胞侵袭性增加.因此，E-cadherin 被认为是一种重要的EMT 标志物[8].此外，E-cadherin 的丢失与各种肿瘤的恶性转移有关，如肺癌、胃癌、乳腺癌等[9].

启动子是一段能够决定基因表达程度和表达频率的DNA 序列.将E-cadherin 基因的启动子与荧光蛋白相连，由于基因启动子的启动或丧失能够引起荧光信号的变化，进而根据荧光判断出EMT 过程中E-cadherin 的表达情况.利用启动子细胞荧光示踪是一种快速、简捷的方法，可以根据荧光的变化快速判断出大分子药物、小分子多肽等是否影响肿瘤细胞的EMT 过程，进而用来进行对化学分子库、小分子药库进行快速筛选.我们通过构建E-cadherin 基因启动子携带有绿色荧光蛋白的慢病毒载体，通过荧光的变化检测细胞的EMT 过程，从而达到体外示踪的目的，为进一步研究肺癌的EMT 过程提供了材料.

1 材料与方法

1.1 材料

pLvx-EF1A-IRES-EGFP 及包装质粒（pVSVG、Δ8.91）由本实验室保存；HEK293T 细胞、肺癌A549细胞购自ATCC；XbaI、XhoI 限制性内切酶购自美国Thermo Scientific 公司；ClonExpress II One Step Clonin购自南京诺维赞公司；EZ-trans 转染试剂购自上海李记生物科技公司；感受态DH5α 购自北京擎科新业生物技术有限公司；1kb DNA marker 购自广东东盛科技公司；蛋白核酸分析仪来自Eppendorf 公司；DMEM 培养基购自GIBCO 公司；胎牛血清（FBS）为Hyclone 公司产品；PBS 购自北京鼎国公司；polybrene 助染试剂购自Merck-Millipore 公司；β-actin抗体购自abcam 公司；GFP 抗体购自上生工生物工程公司；Rabbit 二抗购自碧云天生物技术公司；Ecadherin 抗体购自cell signal-ling technology（CST）公司.

1.2 方法

1.2.1 PCR 扩增E-cadherin 基因启动子

利用NCBI 查找出E-cadherin 的启动子（-2 500～100 bp）序列，利用primer5.0 设计引物，上游引物为5'-GCAGAAATCCACTTTGGCTCGAGGATGAG CCAAGAACTCTGCT-3'，下游引物为5'-GAGGGAGAGGGGCGCGCCTCTAGAAGCGGGCTGGAGTCTGAAC-3'，上下游引物均由北京擎科新业生物技术有限公司合成.

按照基因组提取试剂盒提取HEK293T 细胞基因组，并以该基因组为模板进行PCR，反应体系为：45 ul mix 酶，1 ul 模板，上下游引物各2 ul.反应条件为：98 ℃2 min，98 ℃10 s，58 ℃10 s，72 ℃30 s，72 ℃5 min.反应完成后用1%琼脂糖凝胶进行电泳25 min，将得到的符合长度的片段用DNA 凝胶试剂盒进行回收，用NanoDrop 检测回收的DNA 浓度.

1.2.2 构建重组的慢病毒表达载体

将pLvx-EF1A-IRES-EGFP 慢病毒载体用XhoI、XbaI 两种限制性内切酶进行酶切，酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳20 min 后，进行胶回收.取回收后的载体2 μl，DNA 片段5 μl，酶2 μl buffer 5 μl，ddH2O 6 μl，37 ℃孵育30 min 后，冰上放置5 min.将5 μl 的连接产物加入到50 μl 的大肠杆菌感受态DH5α 中，冰上30 min，42 ℃热激90 s，加入200 μl LB 液体培养基于37 ℃摇床振荡1 h，取适量的菌液均匀涂布于氨苄的培养皿上，过夜培养12～16 h.第二天，挑取单菌落于100 ul 的LB 培养基37 ℃培养2 h，取1 μl 为模板，进行菌落PCR，挑取有条带的样品测序.

1.2.3 细胞培养

HEK293T 细胞和A549 细胞均用含10%的FBS和1%双抗（100 mg/L 青霉素和链霉素）的DMEM 完全培养基进行培养，放置在37 ℃、5%浓度CO2、90%相对湿度的细胞培养箱中进行培养，当HEK293T 细胞密度达到80%可以进行转染.

1.2.4 慢病毒的包装和感染

当HEK293T 的细胞密度达到80%左右，就可以进行转染实验，加样体系如下：pLvx-pE-cadherin-EGFP 质粒12 μg、pVSVG 质粒6 μg、Δ8.91 质粒9 μg，采用Ez-trans 共转染HEK293T 细胞，8 h 后进行细胞换液.转染48 h 和72 h 后分别收取培养皿中的培养基至15 ml 离心管，4 ℃、1 000 r/min 条件下离心5 min，0.45 μm 滤器过滤去除细胞碎片，存储于-80℃低温冰箱.选取生长状态良好的A549 细胞，将2 mL 的pLvx-pE-cadherin-EGFP 慢病毒上清加入其中进行感染，按1 ∶1 000 加入助染试剂polybrene 培养48 h 后换取新鲜培养基，观察感染效果，反复三次加入慢病毒上清进行感染，直到看到明显的绿色荧光，进行扩大培养.

1.2.5 流式细胞仪检测细胞绿色荧光比例

在荧光显微镜下观察感染成功的A549 细胞，进行拍照.并以绿色荧光为标志物，以未感染的A549细胞作为阴性对照，取104个感染成功的A549 细胞用PBS 悬浮，于488 nm 的激发光条件下检测发绿色荧光的细胞所占的细胞比例.

1.2.6 mRNA 表达水平鉴定

将带有绿色荧光的A549 细胞一组加入10 ng/mL TGF-β，培养48 h 后，于显微镜下观察荧光的变化并记录；1%的胰酶消化、富集荧光较亮的细胞，采用RNA 提取试剂盒，提取细胞的总RNA，逆转录成cDNA，RT-PCR 检测E-cadherin 和GFP 的基因表达情况.RT-PCR 引物如下：

hE-cadherin-S：CGGGAATGCAGTTGAGGATC

hE-cadherin-AS：AGGATGGTGTAAGCGATGC

hGFP-S：GACAACCACTACCTGAGCAC

hGFP-AS：CAGGACCATGTGATCGCG

1.2.7 蛋白表达水平鉴定

收取A549 细胞，1×PBS 洗两遍，刮取细胞进入2 ml EP 管中，4 ℃离心1 000 r/min，5 min，加入合适体积的RIPA 裂解液，按1 ∶100 的比例加入蛋白酶抑制剂，冰上放置1 h 后，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，上清即为所需的蛋白溶液，用蛋白核酸分析仪测量蛋白浓度.经SDS-PAGE 分离，湿转法转移至硝酸纤维素膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h.加入GFP抗体（1 ∶2 500），E-cadherin 抗体（1 ∶2 000 稀释），及β-actin 抗体（1 ∶5 000 稀释），4 ℃孵育过夜；TBST 洗3 次，加入HRP 标记的山羊抗兔抗体（1 ∶2 000），室温孵育2 h；TBST 洗3 次，ECL 发光显色.

2 结果

2.1 生物信息学

首先在NCBI 网站及UCSC 网站比对确认Ecadherin 的启动子区域.运用EPD The Eukaryotic Promoter Database（https：//epd.epfl.ch//cgi-bin/）预测转录起始位点上游约3 000 bp 区域，发现该区域具有很强的活性.将-2 746 bp～+74 bp 区域作为启动子的候选区域，根据此区域的DNA 序列设计引物.

2.2 E-cadherin 基因启动子的扩增及鉴定

以HEK293T 基因组为模板进行pcr，条带预计长度为2 800 bp 左右，图1 中可看出有条带位置正确.将pLvx-EF1A-IRES-EGFP 慢病毒载体进行双酶切线性化之后，与目的片段进行连接、转化，挑取单克隆，进行菌落PCR 鉴定.

图1 E-cadherin 基因启动子PCR 产物及菌落PCR 鉴定Fig.1 Identification of PCR product and colony PCR of E-cadherin gene promoter

2.3 慢病毒载体的包装和感染

培养HEK293T 细胞，在细胞长至70%～80%左右，将pLvx-pE-cadherin-EGFP 质粒、pVSVG 质粒、Δ8.91 质粒共同进行转染，48 h 后于荧光显微镜下观察到有绿色荧光，说明慢病毒包装成功，见图2（a）.分别于48 h 和72 h 收集上清，将上述收集的慢病毒上清离心后并用0.45 μm 的无菌过滤头进行过滤，除去杂质，得到的上清用慢病毒滴度快速检测卡快速检测，结果显示病毒滴度大概为1.25×106TU/ml，见（图2（b）（c））.当A549 细胞生长密度达到30%左右时进行感染，反复感染3 次，于荧光显微镜下观察到有绿色荧光，结果如图3（a）.说明慢病毒成功感染A549 细胞，命名为A549-p-E-cadherin；并通过流式细胞仪进行分析，发现GFP 的阳性细胞比例达到4.2%.结果见图3（b）；收集细胞进行Western blot 检测，确定有GFP 的表达，结果见图3（c）.

图2 慢病毒的包装及滴度测定Fig.2 Packaging of lentivirus and determination of lentivirus tit

图3 慢病毒成功感染A549 细胞的验证Fig.3 Verification of successful infection of A549 cells with Lentivirus

2.4 EMT 示踪体系的验证

感染成功的A549 细胞，理论上来说GFP 的变化和E-cadherin 的变化应该保持一致.TGF-β 是一种能够诱导肿瘤上皮型细胞向间质型细胞转化的细胞因子，因此选用TGF-β 来验证该示踪体系是否有效.当用10 ng/ml 的TGF-β 诱导48 h 后，可以看到成功感染慢病毒的A549 细胞的绿色荧光强度相较于未诱导的细胞有明显的减弱，并且观察到A549 细胞的形态发生明显改变，细胞形态由纺锤形变为细长型，结果见图4（a）和4（b）.收集未诱导和诱导后细胞进行RT-PCR 和Western blot 检测，发现经诱导后的细胞内的E-cadherin 和GFP 的mRNA 水平和蛋白水平均降低，并且二者的变化趋势一致，结果见图4（c）和4（d）.因此可以用细胞内绿色荧光的变化来代表E-cadherin 的变化，说明该示踪系统是有效的.

图4 A549 细胞EMT 示踪体系的验证Fig.4 Verification of A549 cell EMT tracer system

3 讨论

已有临床组织学表明，有近一半的非小细胞肺癌组织中E-cadherin 基因的RNA 水平比正常组织中明显下降，主要与其启动子区域的甲基化水平有关[10].而E-cadherin 由于其在细胞粘附中的重要作用，被认为是肺腺中的抑制基因，研究发现E-cadherin 基因启动子区甲基化模式与肺癌的分期进展直接相关[11].在肺癌中，E-cadherin 可以受其他转录因子的调控，如snail、slug 可以结合E-cadherin 启动子上的E-box 原件抑制E-cadherin 的表达，进而抑制EMT 进程[12].而GFP 是一种小分子的绿色荧光蛋白，已经广泛用于多种细胞的示踪[13].本实验中，我们构建了带有E-cadherin 启动子的慢病毒载体，进而感染E-cadherin 高表达的上皮型的A549 细胞，荧光显微镜下观察到大量的绿色荧光，在经细胞因子诱导EMT 之后，绿色荧光减少，并且E-cadherin的表达也随之下降.根据绿色荧光的变化实现对肺癌细胞EMT 过程的示踪，简单方便，有利于对肿瘤细胞EMT 早期进行监控，并且适合对EMT 治疗药物的筛选，是一个快速、方便的筛选平台.

TGF-β 与肿瘤的生长和转移密切相关，其诱导细胞发生EMT 过程中，有多条信号通路如TGF-β-Smad 信号、Wnt/β-catenin、Notch 信号等参与[14].其中，TGF-β 信号通路是诱导EMT 的经典途径，其信号调控通过Smad 和非Smad 两种途径诱导和维持细胞的EMT[15].此外，研究发现在TGF-β 诱导EMT的过程中，可以通过SMAD3 和ERK-MAPK 途径诱导Notch 通路中配体Jagged1 的合成，从而激活Notch 信号通路，而激活的Notch 通路则可以促进TGF-β 信号诱导EMT 的过程[16].此外，TGF-β 与Wnt 信号通路之间也存在相互联系，如Wnt 信号通路的下游分子Axin 通过与Smad 蛋白相互作用促进其与Ⅰ型TGF-β 受体结合，进而激活TGF-β信号通路[17].因此，TGF-β 被认为是经典的诱导EMT的细胞因子.

慢病毒是一种基因工程中普遍使用的逆转录载体，相较于其他的逆转录载体，慢病毒载体不仅具有容纳外源片段大、无毒性且不易诱发免疫反应安全性好等特点，而且还有感染谱广、效率高等优势[18].基于其以上优点，慢病毒载体被广泛应用于基因改造的临床治疗中，如目前的CAR-T 疗法，就是通过向患者的T 细胞转导CAR 序列以达到对患者的T细胞进行改造的目的[19].我们通过对慢病毒的载体进行改造，切去其原有的启动子，换上E-cadherin 基因的启动子，进而感染肺癌A549 细胞，使绿色荧光蛋白能够稳定长期表达，并根据绿色荧光的变化判断出E-cadherin 的变化过程，进而完成对肺上皮细胞EMT 示踪.

综上所述，我们选择以带有绿色荧光的慢病毒为载体，将其原有启动子替换为E-cadherin 基因的启动子，构建E-cadherin 基因启动子的慢病毒质粒.在HEK293T 细胞中包装成慢病毒颗粒，并成功感染肺腺上皮细胞A549 细胞，经TGF-β 诱导后验证该细胞能有效示踪EMT 过程，为肺癌的EMT 的研究提供了材料.