人丝裂原活化蛋白激酶相关蛋白1在肝细胞癌中转录调控的生物信息学分析

张玲玲，曹辉，白班俊，钟竹，杨菁，许钟

贵州大学医学院 贵州省人民医院，贵阳550002

原发性肝癌是最常见恶性肿瘤之一，由于肝细胞癌(HCC)占其中90%以上，因此肝癌也常用来表示HCC。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)属于丝/苏氨酸蛋白激酶[1]，在细胞分裂分化、凋亡、自噬、迁移、蛋白质翻译和修饰以及细胞骨架重建等生物学过程中发挥作用，具有调控肿瘤细胞增殖和凋亡的功能。mTOR以mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)的催化亚基形式存在，而mTORC2及其异常调节信号通路与多种肿瘤的发生有关。Xu等[2，3]研究表明，mTORC2在肝癌发生中具有关键作用。丝裂原活化蛋白激酶相关蛋白1(MAPKAP1)又称mSin1，是多蛋白复合物mTORC2的主要蛋白之一[4]。因此，针对MAPKAP1转录调控的研究，将有助于充分认识肝癌的发生机制。2019年3～8月，我们应用生物信息学方法对MAPKAP1基因启动子区进行序列分析，预测该基因近端启动子区的转录因子结合位点，进一步分析其在肝癌中上调有关的转录因子，为研究其转录调控机制、探索肝癌治疗新思路提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 人MAPKAP1基因启动子区序列的获得 在美国国家生物技术信息中心在线核苷酸数据库(Gene Bank)中获得MAPKAP1基因序列，并基于MAPKAP1的基因序列ID，下载NCBI网站上外链接GeneCopoeia Inc.所提供的启动子序列。

1.2 人MAPKAP1基因启动子区转录因子结合位点的预测分析 在转录因子数据库TRANSFAC中，通过在线转录因子预测软件Patch、P-Match、AliBaba2(http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html)预测MAPKAP1启动子序列顺式作用元件，分析其可能转录因子结合位点。应用Patch在线软件分析，参数设置set of sites选择“vertebrates”，Lower score boundary设为“90”，其他采用默认设置；应用P-Match在线软件分析，限定“liver_specific”，Cut-offs使用参数分别为“to minimize the sum of both error rates”“to minimize false negative matches”；应用AliBaba2在线软件分析，取在线软件默认设置参数。

1.3 肝癌组织中人MAPKAP1基因启动子区可能转录因子的筛选 应用在线肝脏基因数据库Liveratlas(http://liveratlas.hupo.org.cn/)[5]检索，选择“Disease”，以 “hepatocellular carcinoma”为检索词检索，依次点击“HuLDi00052”和“more...”，筛查肝癌组织中表达上调的基因；与预测的转录因子进行对比，获得目标转录因子数据集。

1.4 肝癌组织中人MAPKAP1与启动子区转录因子相关性分析 通过TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/)提取筛选出的转录因子与MAPKAP1的肝癌组织芯片表达结果，采用GraphPad Prism 5统计软件行Pearson相关性分析，P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人MAPKAP1基因基本信息及启动子序列 人MAPKAP1基因ID为79109，定位于9号染色体负链(9q33.3)；其mRNA ID包括NM_001006617.2、NM_001006618.1、NM_001006619.1、NM_001006620.1、NM_001006621.1、NM_024117.3，在肝脏及肝癌中主要为NM_001006621.1、其次为NM_001006619.1、NM_001006620.1等。该基因启动子克隆产品ID为HPRM31628，全长1 689 bp，位于转录起始位点-1 470 bp至+218 bp。

2.2 人MAPKAP1基因启动子区转录因子结合位点预测分析结果 Patch在线软件分析，共预测1 181个转录因子结合位点，手工筛查物种为人的转录因子结合位点共598个，汇总去重后共涵盖149个转录因子。P-Match在线软件分析，当Cut-offs使用参数为“to minimize the sum of both error rates”时，预测到31个转录因子结合位点，汇总去重后共涵盖15个转录因子；当使用参数为“to minimize false negative matches”，共预测到362个转录因子结合位点，汇总去重后共涵盖28个转录因子。AliBaba2在线软件分析，共预测155个转录因子结合位点，汇总去重后共涵盖了63个转录因子。以上软件预测结果汇总共255个，去重后共涵盖214个转录因子。

2.3 肝癌组织中人MAPKAP1基因启动子区可能转录因子筛选结果 应用在线基因数据库Liveratlas提取肝癌组织中表达上调的基因共2 171个，与上述预测的214个转录因子进行对比，取交集获得目标转录因子共有13个：C/EBP、CNBP、CTCF、DBP、IRF2、LEF1、NF1、NFKB1、PAX8、SMAD4、Sp3、SRF、YY1。

2.4 肝癌组织中人MAPKAP1与启动子区转录因子表达的相关性 相关性分析显示，转录因子C/EBP、DBP、LEF1与MAPKAP1表达呈正相关(r分别为0.151 3、0.235 6、0.155 3，P均﹤0.01)，CNBP、CTCF、IRF2、NF1、NFKB1、PAX8、SMAD4、Sp3、SRF、YY1与MAPKAP1表达无明显相关(r分别为-0.036 9、0.000 2、-0.004 0、-0.079 2、-0.132 6、0.042 4、0.033 9、-0.064 3、0.072 3、0.028 5，P均﹥0.05)。

3 讨论

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，流行病学资料显示中国肝癌病例占全球50%以上[6，7]，其发生过程中涉及一系列信号通路的异常活化[8]。由于肝癌异质性大，当前的治疗手段适应范围和疗效有限；对其发病分子机制进行深入探索、寻找新的治疗突破靶点，仍是肝癌研究的一个重要方向。PI3K/AKT/mTOR信号通路由PI3K、AKT和mTOR 3个重要分子节点组成，在细胞的正常生理代谢、肿瘤细胞的发生发展中发挥重要而关键的作用[9～12]。其中，AKT/mTOR通路的活化是肝癌发生最常见的分子事件之一。因此，mTOR抑制剂可以通过特异性抑制mTOR复合物及其信号通路中的各种信号分子而发挥抗肿瘤作用。研究mTORC2的结构、功能、参与的信号通路及机制，可能为探索肿瘤的发生机制及其相关特异性靶向抑制剂治疗肿瘤的研究提供新方向。

mTORC1和mTORC2是mTOR的两种多蛋白复合体。mTORC1主要结构由mTOR催化亚单位、mLST8、调节相关蛋白raptor、负向调节因子DEPTOR和 PRAS40组成，主要功能为调控蛋白质合成、调控细胞生长与增殖，能被雷帕霉素抑制[13，14]。mTORC2在肌动蛋白细胞骨架组织和细胞存活等方面发挥重要作用，由结构蛋白mTOR、mLST8、MAPKAP1、Rictor、Deptor、Protor、Hsp70构成，这些不同的结构蛋白参与不同的生命活动调节过程[15，16]。mTORC2与细胞信号传导关系密切。多种细胞内或细胞外的因素，如生长因子、营养素、能量、应激等，会通过mTORC2调节细胞的生长。Rictor及MAPKAP1是mTORC2构成一个整体的必要条件。MAPKAP1作为mTORC2的主要蛋白之一，具有保持mTORC2结构稳定的功能，可剪切成5个亚基，含有Ras结合区和血小板-白细胞C激酶底物同源结构域，能够抑制Ras信号。MAPKAP1参与mTORC2将AKT Ser473磷酸化过程，其亚型可独立组装mTORC2[17～20]，也是mTORC2亚细胞定位到质膜的必要条件。mTORC2通过mSin1亚基在细胞膜上的定位，使mTORC2靠近其底物AKT、SGK和PKC。因此，细胞膜定位是mTORC2-AKT调控的一个重要方面。MAPKAP1是mTORC2激酶活性的关键负调节因子。尽管生长因子刺激和核糖体结合都是已知的mTORC2激活因子，mTORC2的上游调控仍然不是很清楚[21]。

本研究通过利用生物信息学技术分析发现，在预测的转录因子中共有13个在肝癌中表达上调，其中C/EBP、DBP、LEF1与MAPKAP1的表达呈正相关。C/EBP α是CCAAT增强子结合蛋白家族的一员，作为转录因子参与细胞分化、增殖、代谢以及免疫应答、炎症反应、肿瘤发生等病理生理过程，在多种肿瘤中异常表达。Lu等[22]研究表明，C/EBP α在肝癌组织中表达上调则患者临床预后更差。有报道显示，mTORC2/AKT可通过下游分子上调C/EBP α的表达[23]，但C/EBP α是否影响mTORC2复合蛋白，尤其是MAPKAP1尚有待进一步研究。DBP属于脯氨酸和酸性氨基酸丰富的碱性亮氨酸拉链转录因子家族，在肝脏解毒和药物代谢中起重要作用。持续的DBP上调，可通过激活ERK1/2和 MAPK等信号通路促进癫痫等疾病的发生[24]。但是，DBP是否可通过转录调节MAPKAP1表达未见报道。LEF1是LEF/TCF家族的成员之一，作为Wnt信号通路中的调控分子，可与β-连环蛋白结合来激活下游基因的转录，导致肿瘤的发生发展。Fang等[25]研究发现，LEF1还可通过NOTCH信号通路增加肝癌的侵袭能力和耐药性，与临床患者预后不良相关。目前，尚无关于LEF-1和mTORC2信号通路(包括MAPKAP1)之间相互作用的报道。综上预测及分析，在肝癌发生过程中，转录因子C/EBP、DBP、LEF1可能在转录水平上促进MAPKAP1的表达。此结果可通过小鼠肝癌模型等体内实验进一步验证，其进一步研究为充分阐释mTORC2生物学功能提供生物信息学基础；鉴于目前研究中提示的mTORC2与肿瘤的关系，这可能为探索肝癌的发生机制及研究其特异性靶向治疗药物提供新的思路。