超高效液相色谱联用质谱测定饲料中喹烯酮方法探究

2020-12-30袁艳茹

兽医导刊 2020年10期

袁艳茹

（安阳市畜产品质量安全监测检验中心，河南安阳 455000）

喹烯酮是由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制，农业部于2003年8月批准用于抗菌促生长国家一类新兽药。喹烯酮具有促进动物生长，也有广谱抗菌性。此外喹烯酮无其它喹喔啉二氧化物急性、慢性、蓄积性毒性和致畸、致癌、致突变副作用[1]。因此喹烯酮被广泛用于畜牧养殖中。兽药质量标准2017版规定喹烯酮用于猪饲料时每1000 kg不超过50g（以喹烯酮计），禁用于禽和体重35 kg以上的猪。近年来随着喹烯酮研究不断深入，研究表明，喹烯酮用量增加时，具有一定遗传毒性[2]。实际饲料生产和动物养殖中，喹烯酮超量添加和非法使用现象时有发生，这就需要对畜产品质量安全监管的加强，对喹烯酮滥用及违法使用从源头控制。液质联用法是目前饲料中喹烯酮测定应用较广泛方法，皆因这种方法较其他方法具有灵敏度高、选择性好、检出限低，定性定量准确特点。本文方法也具有上面液质法特点，此外分离度更高，分析速度更快。本文就是基于这种方法对饲料中喹烯酮检测原理，前处理过程、测定过程及结果计算就行了探究。

1 原理的探究

本文采用甲酸乙腈溶液为提取液，既可沉淀蛋白又可提取在这种溶液中溶解喹烯酮，之后超声提取。因亲水亲脂HLB固相萃取柱具有不怕干涸，pH应用范围广，亲水结构有利于保留极性物质，不会吸附碱性物质，用料很少及回收率高的优势，用HLB固相萃取柱净化，氮吹浓缩，再用乙腈溶液溶解，之后上超高效液相色谱联用质谱测定，基质匹配标准液外标法定量。

2 前处理过程探究

因喹烯酮对光敏感，全过程应避光！

准确称取一定量饲料样品（空白样品、用作添加的空白样品、样品）分别于50 ml离心管中，同时准备试剂空白管。用作添加空白样品里加入一定量喹烯酮储备液作为阳性添加样品。每个管中加入60% 0.1%甲酸乙腈溶液10 ml，高速涡动1 min，40 ℃超声提取10 min，充分提取喹烯酮到液体中。10000 r/min离心 13 min，使液体中喹烯酮与饲料固体分离，收集上清液。用提取液重复提取一次，可使喹烯酮达到完全提取目的，合并两次提取液混匀，为总提取液。准确移取5 ml总提取液于60 ℃氮吹至 2 ml，之后加入 0.1 mol/L 磷酸二氢钾溶液 4 ml，充分涡动溶解，为备用液。

准备好HLB固相萃取柱，依次用3 ml甲醇活化，3 ml水平衡，备用液全部过柱，之后依次用0.02 mol/L盐酸 3 ml、5%甲醇3 ml淋洗，主要洗掉一些碱性杂质和极性有机杂质，之后挤干。然后用纯甲醇5 ml洗脱并挤干，收集洗脱液，把喹烯酮用纯有机溶剂从柱子上洗脱下来。60 ℃氮吹至干，浓缩喹烯酮。最后加入20%乙腈充分涡动溶解，为净化液。过滤膜待上机。

由于喹烯酮受基质影响较大，因此用基质标准液外标校准样品。基质标准液制备参见农业部2086号公告-5-2014[3]。因超高效液相色谱联用质谱仪灵敏度很高，基质标准液最高浓度点不宜超过100 ng/ml。实际测定过程中，对于超出最高浓度点的样品，基质标准液应与样品同步稀释，这样重复性和回收率比较好。

3 分析测定过程的探究

色谱柱：BEH C18柱，柱长 5 cm，内径 2.1 mm，粒径 1.7 μm，超高效液相色谱柱体现内径小、粒径小，这种方法有高分离度，高灵敏度、快分析速度。流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序为：起始状态A为6%、B为94%；2.5 min时A为15%、B为85%；3.0 min时A为100%、B为0%；4.0 min时A为100%、B为0%；4.5 min时A为6%、B为94%。流速：0.3 ml/min；进样量：2 μL。色谱柱柱温40 ℃。

质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测，3.0 kV毛细管电压，500℃脱溶剂温度，150℃离子源温度，150 L/h锥孔气流速，1000 L/h脱溶剂气流速，定性、定量离子对以及它们的锥孔电压、碰撞能量为307.16＞131.069、40V、26eV；307.16＞143.093、40V、30eV。

定性定量测定时，离子对选择，保留时间偏差，定性离子确证允许偏差参见农业部2086号公告-5-2014[3]。试剂空白和样品空白不能出现与阳性添加样品相同定性定量离子对的色谱峰。

4 结果计算的探究

结果计算参见农业部2086号公告-5-2014[3]。对于超过标准液最高点阳性样品，需要稀释，计算时乘以稀释倍数。此外阳性添加样品需要计算回收率，阳性添加样品测定含量与实际添加含量的百分比为回收率。回收率主要反应分析方法的合适性和帮助分析人员分析操作过程，以确保分析结果准确。此外还需要计算出两次独立测定结果相对偏差。