土壤中氯代有机物污染生物修复技术

谌伟艳，黄 晟，张 杰，焦海洋，张雪平，许泽英

（江苏省有色金属华东地质勘查局，江苏 南京 210000）

土壤主要分布在地球中的岩石圈表面，是全球最大的生态系统即生物圈的重要组成部分，其质量情况对于维护整个生物圈的稳定性极其重要[1]。如今由于农业化肥农药的过量使用以及工业废水中有毒有害物质的不合理排放，导致大量污染物质以不同形式侵入我国的土壤资源，造成了我国土壤质量的大幅度下滑[2]。土壤质量的下滑，不仅影响了岩石圈，并且通过土壤中地表水流入地下水系统中，从而对水圈亦造成严重污染[3]。基于我国大量土壤资源被大量污染的现状，如何修复受污染严重的土壤资源，应当作为我国环境保护部门的首要工作内容。据目前我国环境保护部门的检测结果来看，土壤中氯代有机物的污染情况最为严重，其是由过量使用化肥而造成的一类持久性环境污染物，其中污染最为严重的氯代有机物为滴滴涕、林丹和六氯苯三种[4]。针对土壤中氯代有机污染物的修复治理工作，一直以来都是我国环境保护部门的重点研究课题[5]。土壤修复技术按照其工作内容可分物理方法、化学方法和生物方法三大类：其中物理方法主要机械化的热处理修复、冲洗修复，其成本投入普遍偏高；化学方法则是采用酸碱综合的原理，应用继续施用化肥来处理，该方法容易引入新污染物；而生物方法是通过定向引入新物种，实现针对氯代有机污染物的吸收、转化、降解、固定等有效措施，从而降低氯化有机污染物在土壤中的含量；因此相比之下生物修复技术被誉为最为节能且环保的技术。在此基础上，本文引入了一种新型微生物修复技术，力争降低土壤中氯代有机污染物的含量，以下为其具体工作内容。

1 新型微生物修复技术

1.1 引入新物种

本文所设计新型微生物修复技术的第一步，就是引入新物种，即培养出高效菌株，吸收并转化土壤中氯代有机污染物含量；其主要工作流程如下：首先选择适应菌株挑选的土壤，所选土壤根据其特征可分为两类，第一类是从受到氯化有机物污染的土壤；第二类是从受到重金属污染的土壤中；从而保证其筛选出的微生物菌株具有极其的适应能力、繁殖能力以及生存能力。其次就是在正确的土壤环境下，采用五点取样法快速且准确的筛选出优质菌种；然后为筛选出的菌株配置适宜的平板培养基，进行富集培养；然后将培养到一定程度的菌株，采用多次平板画线的方式，进行分离培养，其四种画线方法如图1所示，从而确保每一种培养基上仅有一种类型的菌株，其平板画线方法如图1所示。

图1 为培养高效菌种的四种平板画线方法

然后对这些平板进行分类，通常来说，分离出的菌种大体为Pseudom onas me sophillca和m alto philia P，Barton两大类型 ；然后为应用基因工程方法，将重金属抗性基因或编码重金属结合肽的基因转移到针对在污染土壤适应性强菌株的体内，除出这两大类型菌株中的含有的锡、汞、铅等毒性有毒重金属，从而得到高效菌株；最后将得到的高效菌株通过富集培养的方式，加入到土壤环境中，从而土壤中生物多样性。

1.2 转化土壤成分

在得到了新型微生物培养技术之后，就到了应用这些微生物菌株已完成受污染土壤成分的转化环节，其具体的工作流程为：首次采用在将这些微生物菌株均匀的分布到受氯代有机物污染土壤中的同时，加入适应微生物生存浓度的氮、磷、钾等无机盐成分以及电子受体，从而保证所添加的微生物菌株和原有的微生物在土壤中均可稳定的生长和繁殖。其次由于微生物菌种其表面是由编码目的肽的DNA片段通过基因重组的方法构建和表达在噬菌体表面、细菌表面或酵母菌表面，因此其菌株表面的每一个生物大分子或细胞均仅呈现出一种多肽类型。微生物菌株中的高效菌种表面具有多态类型，可以与含有氯代有机物的物质进行紧密的结合，并且通过基因重组的方法与编码细菌表面蛋白的基因相连，高效菌株高效结合肽的方法，可以融合蛋白的形式表达在细菌表面，从而提高其表面与氯代有机物的结合效率。然后将结合之后的菌株其表面会成分为发生变化，观察其表面中LamA、血红蛋白、酵母α-激活酶、a-凝集素和葡萄球菌蛋白A等表面蛋白成分的转变从而在微生物表面展示技术中用来定位、锚定外源多肽.等将六聚组氨酸多肽展示在E.coliLamB蛋白表面，进而提高其针对氯代有机物的吸收能力。之后要将吸收了大量氯代有机污染物的菌株，进行富集比处理，从而将多聚组氨酸与OmpC融合，已保证其菌株群体的吸附的能力可达到16mol/L。通过经数轮筛选和富集，获得对多种氯代有机污染物具有高亲和力的表面多肽，从而将将酵母金属硫蛋白串联体在酵母表面展示表达后，实现提升其4倍～8倍的吸收能力。最后为高效菌株在最大限度吸收了氯代有机污染物的自身清理过程，其体内由于过多积累的氯代有机污染物，可以通过主导运输方式，进行到其细胞内，并在细胞内进行区域性的划化，将有害物质分布到细胞中的内质网工作车间中，实现了将高效菌株内的有害氯代有机物的封闭或转变成为低毒的处理，从而让无毒的高效菌株继续进行土壤的修复工作，通过长期的良性循环，让土壤中氯化有机污染物含量得到最大限度的降低，进而完成针对土壤成分的改善工作。

2 对比实验

2.1 实验准备

本实验选择一块氯代有机物浓度为15.23%的农田作为实验原材料，首先将其等分为相同的两部分；然后采用新型微生物修复技术和传统技术分别对其进行修复；之后对比相同修复时间内两个部分中氯代有机物的含量，验证新型微生物修复技术的实用价值。

2.2 结果讨论

以下为新型微生物修复技术和传统修复技术，对于同一农田在相同时间内修复程度的对比结果。

根据上图数据信息，可以清楚的看出，对比传统技术，新型微生物修复技术可在更短的时间内完成针对受污染土壤的修复工作，且最终将土壤中的氯代有机物含量降低至3.12%；而传统修复技术最终的氯代有机物含量仅降低至3.54%；相比之下新型微生物修复技术多降低了0.42%的氯化有机物含量，由此验证了新型微生物修复技术的实用价值。

图2 为两种修复方法的实验结果对比图

3 结语

本文引入了新型微生物修复技术，已治理土壤中氯代有机物含量过高的问题。之后通过对比传统修复技术的方式，说明了新型微生物修复技术对于降低土壤中氯代有机物含量，具有更好的效果。由此，可验证新型微生物修复技术中的高效菌株，对于降低土壤中氯化有机污染物含量，以及修复污染土壤具有极为重大的意义。

目前，应用微生物技术对受有机物侵害的土壤进行修复，被国际上公认为是一项既节能又环保的环境保护措施[6]。近年来我国针对生物修复技术的研究越来越深入，尤其是针对残留在土壤中的危险物质如TNT、石油、农药、甲基汞等有机污染的研究工作[7]。但因为生物修复技术发展的时间晚，且没有可参考的前人资料，造成其发展速度十分缓慢。由目前的发展来看，要想全面发展生物修复技术，就必须结合生态学、分子生物学、发酵工程、环境化学、植物化学、微生物学和环境工程学等多门学科知识，才能确保我国生物修复技术水平的稳步提升。