单细胞测序及其在寄生虫学研究中的应用

朱 婷， 耿 铭， 李庆伟

(1.辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116081；2.辽宁师范大学 七鳃鳗研究中心，辽宁 大连 116081)

单细胞测序(single-cell sequencing，SCS)是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组或表观组进行的高通量测序技术[1]．在先前的研究中，常常认为生物体同一组织中的群体细胞具有相同功能．然而，组织细胞间的异质性导致了同型细胞在基因功能和表达之间存在不同程度的差异．传统的测序技术只能检测生物体群体细胞的整体表达水平，而非单个细胞水平．随着单细胞测序的出现，在单细胞水平上分析同型细胞基因功能与表达之间的差异性成为可能．

近年来，单细胞测序技术的发展日趋完善，实现了对单个细胞内的基因组、转录组、表观遗传学以及基因组和转录组的平行测序，其中，以单细胞转录组测序的应用最为广泛．以单细胞转录组测序为例，其大致流程包括：分离单细胞(通常包括将组织酶解成细胞悬液)；分离后的单个细胞被裂解，细胞内的RNA分子被捕获并通过逆转录为cDNA进行核酸序列扩增；基因序列测序；对测序结果进行数据分析，通常包括数据批量处理、结果校正、降维和聚类等分析方法[2]．2012年，美国Science杂志成功预测了单细胞研究将成为2013年6大重点研究之首[3-5]．尽管单细胞分析是一项相对较新的技术，但通过高通量测序进行的单细胞组学分析已经应用于数百项研究中，并取得了令人兴奋的新生物学发现[6-9]．单细胞测序技术被广泛应用在发育生物学、微生物学、肿瘤学、遗传学、传染病学、免疫学等诸多领域[10-12]．

1 单细胞分离技术

从生物个体或组织中分离单个细胞是进行单细胞测序的第一步，也是最为重要的一步．但是单细胞的分离仍然具有较大难度，主要表现在所分离单细胞的完整性和纯度、单细胞分离的通量和灵敏度．在实际操作中，常用的单细胞分离方法主要有以下5种(表1)．

表1 常用的单细胞分离方法

2 单细胞测序技术

2.1 单细胞基因组测序

单细胞基因组测序技术(single cell genome sequencing)指在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术．主要是将分离的单细胞全基因组DNA进行扩增，以获得高覆盖率的完整基因组，通过高通量测序揭示群体细胞与单个细胞之间的差异性．

单个细胞所含DNA含量远远低于任何测序技术的核酸量，仅为皮克水平，因此，在进行单细胞基因组测序前要对单细胞进行裂解，再进行核酸序列扩增．目前，单细胞基因组扩增技术中，应用较为广泛的有基于热循环的简并寡核苷酸引物PCR扩增技术(degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR)[18]、基于等温反应的多重置换扩增技术(multiple displacement amplification，MDA)[19]和多重退火环状扩增循环技术(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)[20]．其中，最为领先的是MALBAC，该技术在扩增覆盖率、均一性及灵敏度方面，均有很大提高[21]．MALBAC能够降低PCR扩增偏倚，使得单细胞93%的基因组能够被检测[22]．同时，该技术灵敏度高，对基因组DNA起始量要求较低，0.5 pg即可进行扩增，扩增均匀性明显优于其他技术．在单细胞基因组测序中出现噪音和覆盖度较低或覆盖度不完全时，可以通过检测更多单细胞分析细胞之间的异质性．

2.2 单细胞转录组测序

单细胞转录组测序(single cell transcriptome sequencing，scRNA-seq)通常被称为单细胞RNA测序.该技术通过分离单个细胞，捕获它们的转录本，并生成转录本映射到单个细胞的测序库，从而评估细胞群体和生物系统的基本生物学特性[23]．scRNA-seq可以在单细胞水平分析基因表达情况，其差异分辨率显著高于批量转录组测序，这极大推动了转录组学研究领域的发展[24]．例如，scRNA-seq可用于识别和表征不同免疫细胞亚群的状态，这些免疫细胞的转录特征使得识别新的致病因子和确认生物标志物成为可能[25-26]．scRNA-seq还可用于重建发育“轨迹”，揭示不同细胞亚群的细胞命运决定[27]．

目前，常用的单细胞转录组扩增技术主要有Smart扩增技术(switching mechanism at 5’ end of the RNA transcript)[28]、具有分子标签功能的10×Genomics技术[29]和线性扩增的CEL-seq和CEL-seq2[30]等．其中,Smart-seq和Smart-seq2不仅可以检测每个外显子的表达情况，还能够对获取的转录本进行选择性剪切分析[31-32]．10×Genomics极大地解决了组织群体细胞异质性问题，并且有助于新细胞类型的发现[29]．最新发表的多重退火技术[20]和基于dC尾的定量单细胞RNA测序技术(MATQ-seq)[33]，可以检测相同类型单个细胞之间极小的基因表达差异，并且通过提高逆转录效率增加其灵敏度．

2.3 单细胞表观遗传学测序

生物个体的基本遗传信息储存在核酸中，4种脱氧核苷酸的排列顺序决定了核酸和蛋白质的序列．表观遗传是指在核苷酸序列不发生改变的情况下，调节特定基因的表达并使其产生可遗传的改变，包括组蛋白修饰、RNA干扰、DNA甲基化和染色质重塑等[34]．通过在单细胞水平检测全基因组的甲基化水平发掘高异质性细胞表观遗传信息，为探究癌症等疾病的发病机制[31]和胚胎分化机制提供了重要依据[35-36]．目前，单细胞表观遗传学测序方法主要有单细胞亚硫酸氢盐测序法(single-cell bisulfite sequencing，scBS-seq)[37]、单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序法(single-cell reduced-representation bisulfate sequencing，scRRBS)[38]和三维基因组测序法(high-through chromosome conformation capture，Hi-C)[39]．

2.4 单细胞基因组和转录组平行测序

2015年4月27日，NatureMethods杂志上发布了一项备受瞩目的技术——单细胞基因组和转录组平行测序技术(genome and transcriptome sequencing，G&T-Seq)[40]．该技术能够在单细胞水平实现大规模的DNA和RNA平行测序，揭示单个细胞遗传信息的改变与基因功能之间的关系[41]．G&T-Seq整合的重要意义在于能够定性且定量地获取单个细胞中基因组和转录组的所有信息，同时分析单细胞基因型和表现型之间的关系，深刻揭示单个细胞内遗传信息指导细胞状态的调控机制．目前，G&T-Seq主要应用在癌症研究领域，尤其是循环肿瘤细胞(CTC)，并且在胚胎发育、干细胞多能性、细胞分化、细胞治疗以及CRISPR/Cas基因编辑等领域广泛应用[42-43]．

3 单细胞转录组测序技术在寄生虫学研究中的应用

随着测序技术的飞速发展，极大推动了生命科学领域的新发现，其中，寄生虫学研究领域也受益颇多．利用单细胞测序技术，可以在单细胞水平上探究寄生虫与宿主细胞之间的相互关系,检测和鉴定新的寄生虫物种，在单细胞水平上揭示不同类型细胞对寄生虫生命周期的影响以及寄生虫引起的宿主免疫应答等．下面将主要介绍单细胞转录组测序在寄生虫学研究中的应用(图1)．

图1 单细胞转录组测序在寄生虫学研究中的应用Fig.1 Application of single cell transcriptome sequencing in parasitology

3.1 在虫种鉴定和生长代谢机制方面的应用

在单细胞测序还未得到广泛应用之前，定义寄生虫的组织或细胞类型很大程度上只能局限于形态学特征，很难破译其基因结构；而通过单细胞转录组测序技术则可以获得单个细胞的靶序列，并对其进行相关生物信息学分析．

在疟疾传播方面，处于红细胞内发育期(IDC)的疟原虫停止无性繁殖，转化为配子体的形式存在．Ngara等[44]开发了基于毛细管内单个受感染红细胞(iRBCs)的分离平台，并与scRNA-seq相结合，对疟原虫处于IDC的165个iRBCs进行转录组分析．在IDC期间，通过对单细胞数据的分析将细胞分为多种转录状态．有趣的是，从单个的iRBC分析中发现了一个基因标记分子，它可以成功地在细胞水平上区分无性阶段和有性阶段的寄生虫，继而验证了以前未定义的配子细胞阶段特异性基因．Poran等[45]发现scRNA-seq可区分恶性疟原虫的生命周期阶段，并捕获了细胞分化和细胞周期相关的一些关键事件．虽然细胞特异性功能和基因表达分析受到了缺乏可用标记分子的限制，但通过高通量单细胞测序技术，提供了各种类型的细胞、组织或者有机体的基因表达情况[46-47]，并已经被用于三肠涡虫、扁形虫、地中海圆头涡虫等寄生虫的高分辨率细胞图谱的绘制研究中[48]．

由此可见，单细胞转录组学在分离寄生虫整个生命周期的所有表型及其多个生命周期阶段细胞图谱的开发方面提供了极大助力，这将扩展我们对寄生虫细胞类型多样性的现有理解，并为疫苗和药物开发提供新的候选靶标．

3.2 在生长周期和免疫逃逸机制方面的应用

病原体入侵宿主后，通过多种致病机制损伤宿主．与此同时，病原体为维持其在宿主体内的生存繁殖，需要通过各种方式逃避宿主免疫系统的攻击．疟原虫有一个复杂的生命周期，包括许多不同的发育阶段，同时在宿主中积极逃避宿主免疫．通过微阵列数据集[49]以及scRNA-seq数据集[50]的使用，以2 h为间隔检测24 h，包括以下发育时期：环状体、大滋养体、未成熟裂殖体、成熟裂殖体以及雌、雄配子体等．scRNA-seq可以检测不同生殖阶段的群体细胞，通过伪时间分析确定生长周期中不同细胞的发展顺序[51]．然而，也有一些基因是独立于细胞周期而变化的，它们主要存在于亚端粒区域[52]．

Reid等[53]建立了一种适用于疟原虫scRNA-seq的新方法，不仅可以区分不同的细胞类群，还可以探索细胞与细胞之间潜在的功能差异，揭示了在传播阶段的不同性别差异表达的基因家族，它们通常是与逃避宿主免疫和发病机制相关的．在恶性疟原虫中，var基因家族是通过细胞黏附和抗原变异建立慢性感染的关键[54]，在雄性中没有发现明显变异，而在雌性中表现出转录变异．在无性寄生虫中，2种不同的非编码var转录本的表达是常见的，并参与维持相互排斥的var基因表达，这对它们的免疫逃避作用至关重要[55-56]．因此，scRNA-seq还可以为基因家族中互斥表达基因成员之间的相关转录事件提供新见解，如巴贝斯尼亚牛的ves基因家族和蓝氏贾第鞭毛虫的vsp基因家族[57]等．

3.3 在宿主免疫应答方面的应用

先前研究的是宿主的群体细胞对寄生虫的免疫应答，而通过scRNA-seq还能够揭示宿主免疫细胞应答时的群体细胞差异性，并进一步探究其免疫应答时的分子机制．细胞内寄生虫通过控制宿主细胞的免疫机制以启动和维持感染．传统批量获得的转录组学数据掩盖了寄生虫和宿主细胞之间相互作用的异质性，这些相互作用取决于宿主对感染反应的应答、宿主细胞类型、感染类型、组织组成等．Fontana等[58]发现了在CD4阳性T细胞中，编码巨噬细胞刺激因子(MCSF)的基因Csfl在一类T细胞亚群中高表达；感染过程中CD4阳性T细胞Csfl的选择性缺失，降低了某些骨髓亚群增殖和活化的能力.其中，最显著的是淋巴结CD169阳性巨噬细胞，从而导致感染寄生虫的小鼠恢复受损．感染过程中CD169阳性巨噬细胞的减少也导致寄生虫噬血症增加和宿主死亡率升高．总的来说，在单个细胞水平上捕获病原体和宿主转录本的动态变化对于探究不同感染状态之间的关系非常重要．

最近的研究成功证实scRNA-seq能够同时捕获病毒[59]或细菌[60]与宿主的转录本．虽然宿主-细菌双测序需要捕获非聚腺苷酸转录本，但细胞内寄生虫感染宿主-病原体scRNA-seq联合应用是可行的，而且几乎没有技术障碍．Swierzy等[61]通过单细胞高通量测序，绘制了受弓形虫菌株感染前后的小鼠细胞表达谱，通过对小鼠皮层神经元、星形胶质细胞、骨骼肌细胞和成纤维细胞等差异表达基因分析鉴定，发现弓形虫与其宿主不同类型的细胞之间存在特异性反应．因此推测，不同宿主类型的细胞的异质表达以及寄生虫对它们的适应能力可能干预着寄生虫-宿主的相互作用．

4 小结与展望

单细胞测序广泛应用于个体发育、生理代谢、疾病治疗等方面．但是该技术仍处在不断发展的阶段，还有许多问题需要改进：①在分离单细胞时，首先要保证单细胞的完整性，避免在分离细胞时可能发生的细胞交叉污染等问题，才能保证测序结果的可靠性与数据的准确性；②在测序过程中，核酸扩增技术的扩增效率和信噪比等方面需要进行不断优化和改进；③在scRNA-seq分析中数据归一化和聚类分析领域的研究仍不完善；④相比其他技术，单细胞测序技术的成本还相对很高，限制了其在临床检测、肿瘤研究等领域的广泛应用．相信随着单细胞分离技术、测序技术、生物信息处理技术等环节的日臻完善，越来越多关于寄生虫学的新认识和新见解将会不断涌现，并为该研究领域的拓展和深入带来巨大变革.