八氢番茄红素脱氢酶抑制剂类除草剂的研究进展

孙林静 王 辉 张融雪 苏京平 王胜军 佟 卉 刘燕清 陈志材 李晓莹 孙 玥*

(1.天津市农作物研究所, 天津 300384; 2.南开大学, 天津 300073)

八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene Desaturase，PDS)是植物体内类胡萝卜素生物合成途径的关键限速酶，在质体内参与以异戊二烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)为前体生成类胡萝卜素的过程。由于PDS在光合系统中具有非常重要的作用，因此以PDS为靶点的除草剂被迅速研制出来并得到推广，例如氟啶酮、达草灭和氟咯草酮等[1]。

1 PDS作用通路及定位

1.1 PDS作用通路

八氢番茄红素脱氢酶在类胡萝卜素生物合成中起着非常重要的作用，类胡萝卜素的生物合成需要两个重要前体物质—异戊二烯焦磷酸(Isopenteny diphosphate, IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(Dimethylallyl diphosphate, DMAPP)。通常情况下，在高等植物中，IPP是通过甲基赤藓糖醇(Methyl erythritol phosphate, MEP)途径形成的[2]，即以3-磷酸甘油醛(GA-3-P)和丙酮酸(Pyruvate)为前体物质经过一系列生化反应生成IPP。

如图1所示，IPP在IPP异构酶(Isopentenyl diphosphate isomerase，IPPI)的作用下异构化生成DMAPP，然后DMAPP在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase, GGPS)的催化下与3分子的IPP缩合形成含有C20的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl diphosphate, GGPP)[3]。两分子的GGPP由八氢番茄红素合成酶 (Phytoene synthase, PSY) 催化形成八氢番茄红素(Phytoene)，再由八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase，PDS)催化八氢番茄红素去饱和生成9,9’-二顺式-ζ-胡萝卜素(图2)。接着在ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene isomerase, ZDS)催化下继续脱氢，生成7,9,7’,9’-四顺式-番茄红素，经类胡萝卜素异构酶(Carotenoid isomersase，CRTISO)催化后得到全反式番茄红素(Lycopene)，得到第一个有颜色、具最高数目共轭双键的植物类胡萝卜素[4]，最后再经过一系列环化反应形成各种类胡萝卜素。

图1 植物类胡萝卜素生物合成图[5]

图2 PDS催化反应[6]

1.2 PDS的定位

Grunewald[7]研究发现，PDS基因在植物基因组中是以单拷贝的形式存在的，由其编码的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)定位于植物叶绿体的类囊体上，与类囊体膜相连。由于类胡萝卜素的生物合成是在细胞质中完成的，所以类胡萝卜素合成所需的PDS首先要进入细胞器[8]，然后再转移进入细胞质中才能发挥酶活[9]作用，而PDS的活性高低则取决于其与质膜的结合程度[10]。

2 八氢番茄红素脱氢酶(PDS)抑制剂

PDS抑制剂类除草剂的作用机理是抑制八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene Desaturase，PDS)在植物类胡萝卜素生物合成途径中的催化作用，从而抑制类胡萝卜素的生物合成达到抑制植物光合作用的目的，使植株停止生长直至死亡。因此PDS抑制剂类除草剂属于类胡萝卜素生物合成抑制剂，经此类抑制剂处理后的植株最为明显的表现是产生白化症状[11]。目前世界上进入商品化开发应用的以PDS为作用靶标的除草剂，主要品种有：哒嗪酮类、氟草敏(Norflurazon)；酰胺类、氟丁酰草胺(Beflubutamid)、氟吡酰草胺(Picolinafen)和吡氟酰草胺(Diflufenican)；吡啶类、氟啶草酮(Fluridone)；吡咯烷酮类、氟咯草酮(Flurochloridone)；苯基呋喃酮类、呋草酮(Flurtamone)[12]。其中以氟草敏的使用最为广泛，效果也最好。

氟草敏(Norflurazon)，CAS登记号为27314-13-2，中文别名哒草伏、达草灭，是由山德士公司开发的哒嗪酮类选择性除草剂[13]，被登记用于乔性果树、柑橘、棉花、坚果作物、大豆和蔓越橘[14]。其性状为无色结晶，熔点为175～178 ℃，25 ℃时在水中的溶解度为40 mg/L，易溶于乙醇、丙酮，难溶于烃类，无腐蚀性。由图2可知，PDS催化八氢番茄红素脱氢反应除了需要底物外，还需要NADPH、泛醌、FAD、ATP以及部分金属离子[15]。而氟草敏与PDS所必需的辅酶因子泛醌(PQ)竞争在PDS上的结合位点，从而抑制PDS催化八氢番茄红素脱氢形成ζ-胡萝卜素。

氟吡酰草胺主要用于冬小麦田苗前封闭防除婆婆纳、繁缕、牛繁缕、宝盖草、荠菜和播娘蒿等一年生阔叶杂草，在低温和寒流及霜冻来临前后不宜用药，以防药害。吡氟酰草胺用于小麦、大蒜播后苗前土壤喷雾，是播后苗前处理剂，当杂草萌发通过药土层时，幼芽或根系吸收了药剂从而抑制杂草。氟啶草酮为棉花田专用除草剂，仅限棉田苗前土壤封闭使用，其他作物严禁使用。

3 PDS基因产生抗性的氨基酸位点

近些年来，陆续有学者发现一些植物可对PDS抑制剂产生抗性，深入研究后发现这与PDS基因上的氨基酸位点产生突变有关。2004年，Michel 等[16]研究发现，黑藻PDS基因304位氨基酸由精氨酸突变为丝氨酸、半胱氨酸或组氨酸后，黑藻被赋予氟啶草酮(Fluridone)抗性。2006年，Arias[9]等对黑藻PDS基因304位精氨酸进行突变，发现当304位的氨基酸由精氨酸突变为苏氨酸、半胱氨酸、丙氨酸及谷氨酰胺后，黑藻被赋予氟啶草酮(Fluridone)和达草灭(Norflurazon)抗性。2006年，Steinbrenner等[17]对雨生红球藻PDS基因进行修饰定向诱变，将504位的亮氨酸密码子改为精氨酸密码子，从而使雨生红球藻对达草灭(Norflurazon)的抗性提高了43倍。2008年，Huang等[18]发现在小球藻PDS基因第516位氨基酸上由精氨酸取代亮氨酸后，小球藻对达草灭(Norflurazon)的抗性提高了36倍。2010年，Liu等[19]发现小球藻PDS基因516氨基酸位点处发生突变：苯丙氨酸取代了亮氨酸，该突变导致小球藻对达草灭(Norflurazon)的抗性提高了31倍。2013年，Liu等[20]在莱茵衣藻PDS基因的505位氨基酸位点上以苯丙氨酸取代亮氨酸，得到的莱茵衣藻对达草灭(Norflurazon)的抗性提高了27.7倍。2014年，Suarez等[21]研究发现在绿色莱茵衣藻(The green alga Chlamydomonas reinhardtii)的PDS基因的第131位氨基酸上的苯丙氨酸突变为缬氨酸后，突变后的莱茵衣藻被赋予达草灭(Norflurazon)抗性以及弱的氟啶草酮(Fluridone)、呋草酮(Flurtamone)抗性。见表1。

表1 PDS抑制剂类除草剂抗性植物突变位点

4 结语

农田杂草一直是困扰农业生产发展、阻碍农作物产量提高的主要因素。在我国对农业生产造成危害的农田杂草有1400余种，其中严重危害的有130余种[22]，每年造成粮食产量损失10%左右[23]。随着农村种植业结构的调整、耕作制度的改变，单一类型除草剂的长期使用，农田杂草的种群变化和群落演替加速，除一些次要杂草逐渐成为主要杂草外，一些多年生杂草在农田的发生危害也日趋严重。作为农业生产中主要粮食作物之一的水稻，日益严重的杂草稻危害使得培育出新型的、具有除草剂抗性的水稻品种迫在眉睫。而纵观除草剂市场，以达草灭为代表的广谱、高效、低毒、低残留，减少公害且环境友好的白化除草剂，最为适合抗除草剂水稻品种的研究。对于具有除草剂抗性株系的种植，直接喷洒除草剂，再结合深耕、轮作等传统种植方式，就能有效灭除杂草，成本低、施用简单、环境友好和低毒性的除草剂，具有广阔的前景。本课题组正在开展PDS靶标关键位点突变的抗性研究，期望能创制出新的抗性水稻。