VNP20009 “双靶向性”系统在肿瘤治疗中的应用研究

彭颖征 邓侃

近年来，越来越多的研究者选择以鼠伤寒沙门氏菌作为药物载体进行肿瘤的分子靶向治疗[1-4]。其理论基础主要依据鼠伤寒沙门氏菌在实体瘤乏氧区的特异性[5]。研究表明[6]，靶向性药物很难通过系统给药方式进入到肿瘤的乏氧区，这是目前肿瘤靶向药物实现高效靶向运输需要解决的难题之一，相反，一些厌氧类微生物（如伤寒沙门氏菌）可特异性大量定植于肿瘤组织间的乏氧区，成为抗肿瘤分子靶向治疗的最佳候选载体[7-8]。因此利用scFv78选择性携带某些治疗性物质（如人源化毒素DNAse Ⅰ）与VNP20009双靶向遗传性状稳定的肿瘤血管内皮细胞、周细胞和间质细胞等肿瘤微环境，从而为患者量身打造个体化的治疗方案。

1 材料和方法

1.1 一般材料

MS1、MS1-TEM1细胞由实验室保存。质粒pET302-Gala-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-SV40-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-M9-DNAse Ⅰ-78和pET302-Gala-BIF-DNAse Ⅰ-78由实验室构建。Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit I购自美国OMEGA公司。10 kb plus DNA ladder购自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 构建减毒鼠伤寒沙门重组菌 将pET302-Gala-DNAseⅠ-78、pET302-Gala-SV40-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-M9-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-BIF-DNAse Ⅰ-78这四种质粒各取1 μL于1.5 mL的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。打开电转仪，将此混合物转移至已预冷的电极杯中，取20 μL转化产物加160 μL SOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看后筛选可在含氨苄的LB培养基上生长的阳性克隆。

1.2.2 重组蛋白的表达及功能验证 挑取克隆在LB（含氨苄抗生素）液体培养基中小量培养细菌并破碎，用亲和层析法（目的蛋白有六个组氨酸标签可用于蛋白纯化）分离纯化细菌包涵体中的目的蛋白，缓慢加入到复性液（2M的尿素），36～48 h，8 000 r/min离心后浓缩至合适体积按1∶4的比例与His beads结合，通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白位置和大小，在膜表面加入显色液凝胶成像仪里显色。

1.2.3 体外评价重组蛋白抑杀细胞的能力 通过流式细胞技术验证目的蛋白对MS1-TEM1细胞的特异性和对DNA降解能力后，培养MS1和MS1-TEM1细胞，加入不同浓度的重组蛋白，设置浓度梯度，0 nM，15 nM，30 nM，60 nM，0.125 μM，0.25 μM，0.50 μM，1.00 μM。

2 结果

2.1 重组蛋白对MS1-TEM1的特异性靶向效果

将重组蛋白与不表达TEM1的MS1细胞和表达TEM1的MS1-TEM1细胞共孵育，结果显示，所有重组蛋白与MS1细胞均无特异性结合效果（如图1、2所示）。对MS1-TEM1细胞而言，带有scFv78的蛋白其他表达载体皆可特异性与MS1-TEM1细胞相结合。

图1 重组蛋白对MS1细胞的靶向作用

2.2 重组蛋白对DNA的消化实验

实验结果表明，所构建的蛋白均可彻底降解溶液中的DNA，其降解效果与商品化DNAse Ⅰ无差别（如图3所示）。

3 讨论

目前，肿瘤治疗主要以手术治疗为主，术后根据临床分期及组织学类型等决定是否辅以放化疗等防止复发转移。该类疗法的缺点主要是对浸润型肿瘤无法做到根治，且放射线和化疗药物会同时伤害到人体的正常细胞，给患者身体造成较严重的伤害[9]。因此，欧美等国家建议限制放化疗在癌症治疗领域的应用[10]。随着医学科技的进步，越来越多的肿瘤患者选择靶向性药物进行治疗[11]，其对健康组织影响较小，是目前最理想的治疗模式，也代表着肿瘤治疗的未来趋势。

前期通过构建一系列表达载体pET302-Gala-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-SV40-DNAse Ⅰ-78、pET302-Gala-M9-DNAse Ⅰ-78和pET302-Gala-BIF-DNAse Ⅰ-78，其中，组件Gala为逃逸序列，有助于蛋白进入细胞后避免被囊泡吞噬而失去杀伤效果；组件SV40、M9、BIF为核定位序列，有助于蛋白进入细胞后特异性靶向细胞核基因组，降解DNA从而达到杀伤肿瘤细胞的效果。

scFv78为筛选得到的单链抗体，可使蛋白特异性聚集在表达TEM1的肿瘤微环境，是生物药物的导航系统；DNAse Ⅰ为DNA降解酶，可降解单链和双链DNA，是生物药物的炸药[12]。将前期筛选得到的、可特异性靶向肿瘤标示分子TEM1的单链抗体基因scFv78与人源化毒素DNAse Ⅰ通过电转化将表达载体转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，筛选阳性克隆后通过体外细胞实验验证该人源化融合蛋白对肿瘤细胞的靶向效果，总之本研究结合筛选到的特异性靶向肿瘤标示分子TEM1，可达到“双靶向”的治疗效果，为以后的肿瘤治疗提供了新思路。

图2 重组蛋白对MS1-TEM1细胞的靶向作用

图3 重组蛋白对DNA的消化实验