离体肝脏常温机械灌注设备对红细胞影响的实验研究

何锡然，黄小桃，谭晓宇，张琳，刘华敏，邝伟键，梁铭炬，周伟津，郭家钘，陈素平，霍枫

1. 广东顺德工业设计研究院（广东顺德创新设计研究院），广东 佛山 528311；2. 中国人民解放军南部战区总医院 肝胆外科，广东 广州 510010；3. 广东丁沃生医疗器械有限公司，广东 佛山 528311

引言

肝移植是治疗终末期肝脏疾病的有效方法。然而由于供肝来源相对匮乏，严重限制了该项技术的临床应用。数据显示，美国每年新增肝移植等待者约10000人，等待者常年超过15000人，但每年仅能完成6000例移植手术[1]。我国是肝病大国，终末期肝病患者达800万，每年约30万人死于终末期肝病，其中只有不到1%患者获得肝移植机会[2]。为了解决供肝需求问题，以往认为风险较大的边缘供体或者扩大标准供体逐渐用于临床。边缘供肝包括高龄、心死亡、器官功能严重异常等供体来源的供肝，也包括长时间冷保存和中重度脂肪变性等的供肝[3]。因为缺乏科学有效的评估手段，边缘供肝的质量难以评价以至于弃用率较高[4]，使用后对移植受者预后影响较大[5]。虽然传统静态冷保存可以降低组织代谢和氧需求量延长保存时间，但同时也导致细胞水肿和细胞损伤[6]。边缘供肝长时间的冷保存，移植失败风险和受体死亡率显著增加[7]。已有研究认为常温机械灌注技术（Normothermic Machine Perfusion，NMP）可以减少供肝冷保存损伤[7]，并评价供肝质量[8-9]。此外，NMP通过灌注液为器官供氧和提供代谢底物的同时，可以添加保肝护肝药物，有可能对供肝损伤起到修复作用[10]。目前国内还没有市场化的肝脏NMP设备，国外也仅处于获得欧盟认证阶段。本项目组构建了离体肝脏NMP设备。目前常温机械灌注最常用的氧载体为红细胞[11]，本研究对设备在灌注过程中对红细胞的影响进行了初步探究。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料

1.1.1 实验动物

选取清洁级健康雌性巴马小型猪6只，体重45～50 kg，由解放军南部战区总医院动物实验中心提供。每头实验猪作为血液和肝脏的供体。所有动物均符合南部战区总医院动物实验伦理委员会要求，在动物实验中心饲养和实验操作。

1.1.2 实验设备

常温机械灌注设备DEVOCEAN-LIVER 2000，该设备由广东顺德工业设计研究院（广东顺德创新设计研究院）、解放军南部战区总医院、广东丁沃生医疗器械有限公司联合研发。该装置可对离体肝脏进行肝动脉和门静脉双重灌注。设备主要构建部件有：2个离心泵（Revolution Centrifugal Pump，Sorin Group Italia S.r.l.）；2个 氧 合 器（EUROST EU5032 TRILLY Infant-Paediatric Oxygenator，EUROSETS S.r.l.）；温度传感器（精密型，佛山市亨远电子有限公司）；2个压力传感器（洛瑞，深圳市顺美医疗股份有限公司）；2个流量传感器（co.56/080，SONOTEC GmbH）；2个滤血栓（儿童，东莞科威医疗器械有限公司）；胆汁计数器；温控水浴箱；自制的储肝器、自制的灌注管路以及自制门静脉、肝动脉、胆管连接管路等。各部件连接方式如图1所示。

图1 离体肝脏常温机械灌注系统示意图

1.1.3 仪器与试剂

呼吸机（S1100型，南京舒普思达医疗设备有限公司）、多参数监护仪（M-9000S，深圳市艾瑞康医疗设备有限公司）、全自动雪花制冰机（IMS-70，常熟市圣海电器有限公司）、全自动生化分析仪（Pointcare M3，天津微纳芯科技有限公司）、雅培i-STAT300血气分析仪（美国雅培）、电子称（HY-809B，至尊）、一次性医用静脉留置针（24G，江西丰临医用器械有限公司）、导尿管（16Fr双腔，湛江事达实业有限公司）、硫酸阿托品注射液（天津金耀药业有限公司）、舒泰50（法国维克有限公司）、丙泊酚乳状注射液（西安力邦制药有限公司）、高渗枸橼酸盐嘌呤溶液（上海输血技术有限公司）、肝素钠注射液（江苏万邦生化医药集团有限责任公司）、羟乙基淀粉130/0.4电解质注射液（山东齐都药业有限公司）、注射用头孢西丁钠（国药集团致君（深圳）制药有限公司）、注射用甲泼尼龙琥珀酸钠（P fizer Manufacturing Belgium NV）。

1.2 猪血液及肝脏获取

实验猪耳后肌内注射硫酸阿托品注射液0.05 mg/kg，15 min后耳后肌肉注射舒泰50 2～3.5 mg/kg进行基础麻醉。诱导麻醉后，猪耳缘静脉留置套管针建立输液通道，利用微量注射泵以每小时2～5 mg/kg的剂量泵入丙泊酚进行维持麻醉。气管插管，连接呼吸机，维持动物正常呼吸。

腹部正中线大切口进腹，游离腹主动脉、下腔静脉及门静脉。经耳缘静脉注射25000 U肝素钠，随后于腹主动脉和下腔静脉置入自制16-Fr导管，利用内含12500 U肝素钠和8 mL生理盐水的储血袋收集血液。血液收集过程自动过滤去除白细胞。

静置实验猪60 min（即热缺血60 min）后，结扎胸主动脉，腹主动脉插管，备4℃高渗枸橼酸盐嘌呤溶液1 L；同时进行门静脉插管，备4℃高渗枸橼酸盐嘌呤溶液1 L；剪开肝静脉出口，进行在体冷灌注。快速取下肝脏，置入含4℃生理盐水的容器。修整肝脏后，进行肝动脉和胆道插管。

1.3 常温机械灌注液和常温机械灌注参数设定

所有离体肝脏均采用常温机械灌注，灌注时间为8 h。

NMP灌注液配制：灌注液总体积为1500 mL，包括猪全血，羟乙基淀粉130/0.4电解质注射液，800 U肝素钠注射液，1 g注射用头孢西丁钠，500 mg注射用甲泼尼龙琥珀酸钠。

启动灌注液循环即开始利用氧合器供氧，给氧浓度为60%，气体流量与血液流量之比为1：1，氧分压在300～350 mmHg。肝动脉和门静脉连接管分别按图1所示连接循环管路。灌注温度为37℃，肝动脉灌注压力设定为80/60 mmHg，门静脉灌注流量按照肝脏重量设定为0.5 mL/[min·g（肝重）]。

1.4 观察指标

灌注过程，设备自动记录灌注液温度、肝动脉流量和门静脉流量。灌注开始时及之后每小时取适量灌注液，化验红细胞压积（Hematocrit，HCT）、血红蛋白（Hemoglobin，HGB）、总胆红素（Total Bilirubin，TBIL）、间接胆红素（Indirect Bilirubin，IBIL）、溶血率、乳酸（Lactate，Lac）以及血糖（Glucose，Glu）等。

1.5 统计学方法

采用SPSS23.0统计学软件进行统计学分析。所有计量资料以均数±标准差（>±s）表示。样本服从正态分布，采用配对t检验灌注前后差异，若样本不服从正态分布则采用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 物理参数

灌注过程中，灌注液温度稳定在37 ℃。肝动脉初始流量最低值为（54.64±11.94） mL/min，随着灌注过程延长，最高达到（249.34±93.01） mL/min。门静脉采用恒流模式控制，流量平均值稳定在（442.67±79.19） mL/min。结果如图2所示。

图2 灌注温度和流量

2.2 HCT与HGB水平

灌注开始时HCT为（27.67±2.42）%，灌注8 h HCT为（28.00±2.45）%，两者相比，无统计学差异（P＞0.05）。灌注初期HGB为（9.40±0.81）g/dL，灌注8 h为（9.52±0.81）g/dL，两者相比无统计学差异（P＞0.05）。结果详见图3。

2.3 胆红素水平

灌注开始时TBIL为（4.43±1.36）μmol/L，灌注8 h TBIL为（4.40±1.67）μmol/L，两者水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。IBIL在灌注开始时为（1.43±1.04）μmol/L，灌注8 h为（1.73±0.47）μmol/L，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。TBIL和IBIL在灌注过程中未见明显升高，结果如图4所示。

图3 灌注液的HCT和HGB

图4 灌注液的胆红素水平

2.4 溶血率

灌注开始和之后每小时化验灌注液样本，均显示无溶血，各时间点溶血率均为0，见表1。

表1 灌注过程中的溶血情况

2.5 Lac和Glu水平

灌注过程中，初期Lac水平为（2.52±0.39）mmol/L，灌注8 h Lac为（0.35±0.07） mmol/L，数据比较，具有统计学差异（P＜0.05）。葡萄糖灌注开始时为（14.62±5.12） mmol/L，灌注1 h水平最高，为（21.37±5.96） mmol/L，灌注8 h为（9.78±2.63） mmol/L，灌注8 h与灌注开始以及灌注1 h相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05），结果如图5所示。

图5 灌注液的Lac和Glu水平

3 讨论

常温下离体肝脏NMP是近年来器官移植领域研究的热点。该技术与低温机械灌注或传统冷保存不同，灌注液主要使用全血或红细胞悬液。因此机械灌注过程中，磁悬浮驱动灌注液进行长时间循环，是否会造成红细胞溶血、破坏抑或消耗，是否可能导致红细胞携氧能力下降，是否会影响离体肝脏功能等问题，对设备实验或临床应用至关重要。

临床上反映红细胞损耗的指标常用HCT、HGB和溶血率。HCT是指血细胞在血液中所占容积的比值，反映红细胞的增多或减少[12]。HGB是一种结合蛋白，是血液中红细胞携带、运输氧气和二氧化碳的载体。血液中98.5%的氧气是与HGB结合成氧合HGB的形式存在和运输的[13]。溶血则是指红细胞破裂，HGB逸出。机械性强力振动是溶血的常见原因之一。本研究利用自主构建的常温机械灌注设备进行小型猪离体肝脏灌注实验，过程中对这三个指标进行动态检测，结果显示持续灌注8 h对HCT、HGB水平没有影响，不会导致溶血。

为了进一步了解红细胞携氧能力及灌注过程是否能改善离体肝脏功能，本研究在实验过程动态检验灌注液TBIL、IBIL、Lac和Glu的水平，并监测肝动脉和门静脉流量。胆红素是血液循环中衰老红细胞在肝、脾及骨髓的单核-吞噬细胞系统中分解和破坏的产物，人体中由红细胞破坏产生的胆红素占TBIL的80%～85%，当红细胞破坏过多时可引起胆红素代谢障碍，当TBIL增高伴IBIL明显增高提示为溶血性黄疸[14]。本实验灌注过程中，TBIL和IBIL均比较平稳，未见明显波动，进一步证明了项目组构建的设备不会导致溶血。血中Lac增多是组织严重缺氧时，糖分解代谢中的丙酮酸无氧酵解途径生成Lac作用加强所致[15]。在氧供充足的情况下，葡萄糖进行有氧氧化，生成二氧化碳和水，在缺氧情况，葡萄糖进行无氧酵解，生成Lac[16]，提示Lac和葡萄糖水平可作为组织缺氧的指标，间接证明红细胞的携氧能力。本研究灌注过程中，Lac和葡萄糖均被明显消耗，间接提示了本研究灌注液中红细胞具有较好的携氧能力，能够改善离体肝脏功能。

Banan等[17]利用猪为动物模型，研究离体肝脏机械灌注系统对不同热缺血损伤的肝脏的保存效果，他们将灌注液HCT控制在15%～20%，结果发现NMP能够稳定转氨酶水平，同时可以增加胆汁生成和降低Lac水平，组织学评价显示NMP能够改善坏死和缺血再灌注损伤。Bral等[18]利用动物模型研究不同HGB水平灌注效果，发现HGB在20～30 g/L之间有助于降低Lac和Lac脱氢酶。Watson等[19]使用荷兰的liver assist仪器进行常温机械灌注对废弃人肝进行研究，灌注液中的HGB水平和HCT分别设定为6.1 g/dL（范围：5.1～7.4）和18%（范围：16%～22%），结果显示该常温灌注条件能够对肝脏进行有效评价，并且肝脏能够进行肝移植手术。以上研究显示，目前尚无统一的常温机械灌注HCT标准。

Bral等[20]使用OrganOx公司的常温机械灌注设备对人肝脏进行离体灌注临床研究，该常温灌注的HGB水平为（104±18）g/L，HCT水平为（32±5）%，平均灌注时间为11.5 h，结果显示所有肝脏在移植后均能发挥功能，证明了常温灌注技术的安全性。Den Dries等[21]利用liver assist对四个废弃人肝进行了常温灌注，在该研究中，灌注前、灌注 30 min和灌注6 h的HGB 水平分别为（4.7±0.1） mmol/L，（3.8±0.1）mmol/L，（3.9±0.2） mmol/L，而HCT水平则为（0.23±0.01）%（，0.19±0.01）%，（0.20±0.01）%，灌注结果显示NMP能够显著降低Lac水平，改善肝细胞功能，同时也提示常温灌注需要稳定的HCT和HGB水平。本研究数据显示我们构建的设备能够将灌注液HCT、HGB、TBIL和IBIL维持在一个稳定的水平，灌注液溶血率为0，而且可以改善灌注液Lac和Glu水平。此外，灌注过程中，肝动脉流量逐渐增加，提示肝脏血管阻力下降、微循环改善，也间接反映了肝脏质量改善。

4 结论

灌注过程，HCT、HGB、TBIL和IBIL均能维持稳定，而且每小时的溶血率均为0，提示设备能够在灌注过程中稳定红细胞的数量。持续的Lac和葡萄糖消耗，间接提示红细胞的携氧能力有助于改善肝功能。但是评价红细胞的功能需要检测更多指标，如红细胞变形能力、游离HGB水平、网织红细胞计数、血小板、外周血细胞活化特异性释放产物等。同时今后将会开展更长时间的灌注时间，包括12 h和24 h，以进一步评价设备在长时间灌注时对红细胞的影响。另外，将设计实验探讨不同HCT水平的灌注液对离体肝脏的影响。