动脉粥样硬化疫苗的研究进展

林宸诗，陈玉红，尹莉芳

（中国药科大学药学院药剂学教研室，南京210009）

动脉粥样硬化是一种慢性炎症疾病，疾病特征是动脉壁上的脂肪条纹逐渐发展成动脉粥样硬化和特征性斑块，这些动脉粥样斑块的急性破裂会形成局部血栓，导致病灶动脉的部分或全部闭塞，主要临床表现包括缺血性心脏病、缺血性脑卒中和周围动脉疾病。动脉粥样硬化及其伴随的临床并发症如脑卒中和缺血性心脏病，是全球死亡事件的主要原因，2016 年约有1 790 万人（占全球死亡总数的31%）死于此类心血管疾病。2013 年，中国缺血性心脏病和脑卒中的住院总费用为705亿元，给国家和患者带来巨大的经济负担。

临床数据表明，动脉粥样硬化与免疫介导的炎症有关，特异性及非特异性免疫细胞，例如巨噬细胞、T 淋巴细胞、树突状细胞（dendritic cells，DCs）、肥大细胞、B淋巴细胞等，在动脉粥样硬化斑块中普遍存在［3］。诸如病原体、免疫球蛋白、细胞因子和趋化因子之类的炎症介质在动脉粥样硬化斑块中分布不均。在小鼠主动脉中易发生动脉粥样硬化的部位（比如血管外膜），抗原呈递细胞的数量比正常部位多，这些证据均表明动脉粥样硬化的部位存在炎症反应［4］。

1 非特异性免疫和动脉粥样硬化

生物体对病原微生物和病原体的非特异性即时反应称为非特异性免疫。非特异性免疫系统细胞（DCs和巨噬细胞）作为第一响应者，检测内环境中的疾病相关分子，即氧化低密度脂蛋白（oxygenized low density lipoprotein，oxLDL）的表达。非特异性免疫细胞接触这些疾病相关分子，并与Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）相互作用。TLR 识别疾病相关分子，引起急性炎症基因的激活和急性非特异性免疫炎症介质的释放。敲除非特异性免疫信号通路基因的小鼠无论血液中胆固醇水平高低，都呈现动脉粥样硬化症状减轻现象，表明非特异性免疫在动脉粥样硬化中起作用［5］。

巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）基因对巨噬细胞增殖起促进作用。高脂血症小鼠的M-CSF 基因被敲除，显示动脉粥样硬化减少的现象［6］。各种巨噬细胞在非特异性免疫中发挥作用。在小鼠中发现了两种亚型的巨噬细胞：一种具有高表达的Ly6C，具有促进炎症的作用［7］，是促炎M1 巨噬细胞的前体。另一种亚型是M2 巨噬细胞，与动脉粥样硬化斑块的分类有关［8］。

自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）是促进动脉粥样硬化的非特异性免疫细胞。用Ly49A 转基因小鼠的骨髓细胞移植的低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）受体缺陷型（LDLR-/-）小鼠，缺乏功能性NK 细胞，与从非转基因供体接受骨髓细胞的LDLR-/-小鼠相比，主动脉根部有小范围动脉粥样硬化斑块生成［9］。有研究报道NK细胞的致动脉粥样硬化功能依赖于如穿孔素和颗粒酶B等介质［10］。

肥大细胞也会影响动脉粥样硬化进程。在缺乏肥大细胞的高脂血症小鼠中，炎症减少，病变进程减慢。有研究报道了肥大细胞缺陷小鼠的胆固醇水平较低，这表明先天性肥大细胞信号传导与胆固醇体内平衡之间存在联系［11］。

DCs是特异性和非特异性免疫系统的桥梁，是免疫细胞活化过程中的上游成分，DCs独特的地位使它成为疫苗研发重要的靶点。高脂血症中，内膜上的DCs迅速摄取脂质，而注射CD11c特异性白喉毒素受体（diphtheria toxin receptor，DTR）的转基因小鼠DCs 缺失，引起LDLR-/-小鼠的早期病变减慢，证明了DCs 的促动脉粥样硬化作用［12］。血浆样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）存在于鼠和人类的动脉粥样硬化斑块中，pDCs 对oxLDL 的反应激活抗原特异性T 细胞，注射抗小鼠pDCs 抗原-1 抗体的ApoE-/-小鼠缺少pDCs，减缓主动脉窦动脉粥样硬化进程，斑块炎症减少，T 细胞的活化被全面抑制［13］，证实了pDCs 通过激活自身抗原诱导免疫反应促进动脉粥样硬化［14］。

2 特异性免疫和动脉粥样硬化

与非特异性免疫系统的迟缓、非特异性相比，特异性免疫反应目标更为明确。免疫母细胞的发育产生识别特定抗原的多种T细胞和B细胞。

非特异性免疫细胞例如DCs 和巨噬细胞，呈递经T细胞识别的抗原，形成了主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）。呈递抗原后，激活T细胞并增殖。CD8+T细胞大量增殖，产生细胞因子，对抗原具有特异性细胞毒性。CD4+T 细胞激活也产生细胞因子促进随后的B 细胞激活并产生特异性免疫球蛋白。

研究表明B 细胞能延缓高胆固醇血小鼠动脉粥样硬化进程［15］。B1 细胞产生的免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）M 同 型 的 天 然 抗 体 可 与oxLDL 的极性基团反应，可促进B 细胞的抗动脉粥样硬化作用［16］。大量实验数据表明，B细胞在动脉粥样硬化中的作用受细胞亚型的影响，B1 细胞具有抗动脉粥样硬化作用，B2 细胞具有促动脉粥样硬化作用［17-18］。

动脉粥样硬化斑块含有DCs、充当抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APC）作用的巨噬细胞和T 细胞。APC-T 细胞相互作用表明了可通过斑块中的突触激活特异性免疫（图1）。在共刺激分子如CD40，CD80 等作用下，DCs 可向T 细胞呈递动脉粥样硬化抗原（如oxLDL 和HSP-60），引起T细胞分化和增殖，并分泌细胞因子［19］。将CD4+T细胞移植到免疫缺陷型高脂血症小鼠体内，观察到动脉粥样硬化的加重［20］。CD4+T 细胞的促动脉粥样硬化作用部分是由于Th1细胞因子反应，特别是干扰素-γ（IFN-γ）的强烈的促炎作用。移植CD4+T 细胞，对LDL 的反应导致动脉粥样硬化加剧，说明LDL 是CD4+T 细胞应答的抗原［21］。另有研究表明Th2 细胞因子反应（如IL-10）可以防止动脉粥样硬化［20］。除了CD4+细胞外，其他免疫细胞，如巨噬细胞、肥大细胞和NK细胞也可分泌Th2细胞因子抑制动脉粥样硬化［22］。

图1 APC和T细胞间的作用

CD4+T 细胞是动脉粥样硬化研究领域热点之一，它的另一亚型是CD4+调节性T 细胞（Treg）。Treg细胞标志物是转录因子的表达产物——FoxP3。使用白喉毒素受体转基因法或通过针对FoxP3 的疫苗使FoxP3+细胞选择性缺失，加速高胆固醇血小鼠的动脉粥样硬化进程［23］。因此，CD4+Treg细胞能够减缓动脉粥样硬化。

CD8+T 细胞最初不是研究的焦点，是由于基因敲除严重降低了CD8+T 细胞的数量，难以观察到其对小鼠的动脉粥样硬化影响［24］。近期研究报道，在高胆固醇小鼠中，CD8+T 细胞先于CD4+活化［25］，CD8+T 细胞促进高胆固醇血小鼠的动脉粥样硬化进程［26］。CD8+T 细胞达到最高水平三分之一的患者在随访期间，冠状动脉疾病发生率增加［27］。因此，与CD4+T 细胞相似，CD8+Treg细胞也促进动脉粥样硬化。

综上所述，特异性免疫系统和非特异性免疫系统的许多组成部分均参与调节动脉粥样硬化，这些组分之间的复杂的相互作用可导致动脉粥样硬化的恶化或改善（表1）。鉴于特异性免疫系统在动脉粥样硬化中的主要作用，其疫苗疗法为动脉粥样硬化治疗提供新思路。正在研究的几种用于疫苗接种的候选抗原，LDL 及其蛋白质复合体（ApoB-100）位于前列。

3 动脉粥样硬化斑块内相关抗原

抗动脉粥样硬化的疫苗治疗方案是诱导机体产生特异性免疫应答。这种方法的难点在于确定与动脉粥样硬化形成相关的特异性抗原，使其可用于激活抗原特异性免疫应答。大多数寻找潜在抗原的研究仍处于临床前试验阶段（表2）。

3.1 外源性抗原

探索抗原的合理方法是将重点放在病灶本身即动脉粥样硬化斑块。在动脉粥样硬化斑块中已发现许多外源抗原，包括肺炎支原体、肺炎衣原体和牙龈卟啉单胞菌等，肠道病毒、人类免疫缺陷病毒、巨细胞病毒和丙型肝炎病毒等病毒。至于这些病原体是否引致动脉粥样硬化，仍未能确定。

牙周病原体最近在研究中受到重视，许多人发现牙周病患者多伴随动脉粥样硬化疾病［28］。实验动物暴露于牙龈卟啉单胞菌后，动脉粥样硬化加剧，而对牙龈卟啉单胞菌的免疫减缓了动脉粥样硬化［29］。不过这些病原体在人类动脉粥样硬化中的直接作用仍然是不确定的，目前尚不清楚靶向牙周病原体的疫苗是否适用于人类动脉粥样硬化患者。

表2 部分疫苗临床前研究进展

表1 免疫细胞与动脉粥样硬化的作用

3.2 内源性抗原：LDL和ApoB-100衍生抗原

因为LDL和其他含有ApoB-100的脂蛋白是动脉粥样硬化血栓形成的主要原因，所以源自它们的抗原是疫苗开发的首选。使用不同辅助基团修饰疫苗制剂中的全天然或oxLDL，在实验动物身上已经证明了其免疫效果。然而，抗原的确切表位和机制尚未完全清楚。

由于LDL 是多种甘油三酯、载脂蛋白、磷脂和胆固醇酯等组成的大分子物质，所以在临床可用的疫苗制剂中使用天然的LDL 作为抗原是不实际的。LDL 分子的复杂性使得分子内的免疫原性表位难以确定。鉴于使用LDL 作为抗原免疫得到了良好的实验数据，确定LDL 中的抗动脉粥样硬化抗原表位是重中之重。为此，Antoniak等［30］做了广泛研究，以确定ApoB-100（LDL 和其他致动脉粥样化脂蛋白的主要蛋白质组分）中的潜在抗原表位，然后将其作为抗原通过免疫实现抗动脉粥样硬化作用。研究最初筛选了由4 536 个氨基酸组成的人体ApoB-100 蛋白，并设计了跨越整个ApoB-100序列的302 个肽库（每个20 个氨基酸，与前一个序列具有5-氨基酸重叠）。在这些20聚体肽序列中，鉴定了在人血浆中检测到具有抗体的免疫应答的102 种肽。随后的测试显示，当该疫苗制剂用于高脂血症小鼠时，几种免疫反应性肽（包括p2、p143、p210）使动脉粥样硬化现象减少40%～70%［31］。因为基于p210的疫苗具有最持久的抗动脉粥样硬化作用，有研究团队已经使用p210 作为疫苗制剂中的原型抗原［32］。由于表位研究使免疫学研究更精准，所以使用ApoB-100肽作为抗原，是开发动脉粥样硬化疫苗的临床前关键步骤。

3.2.1 p210疫苗 与对照受试者相比，使用p210疫苗免疫的患者主动脉粥样硬化显著减轻［33］。设计实验研究p210 IgG 滴度的变化，对照组25 周内IgG滴度无明显变化，但实验组在25周时表现出高p210 IgG 滴度，且接种p210免疫的小鼠IgG 滴度显著低于仅接受佐剂的小鼠。这一观察结果表明：（1）p210 疫苗诱导抗体类转换为IgG；（2）p210 IgG可以作为疫苗接种的标志物。

除了减少主动脉粥样硬化之外，p210 疫苗还激活CD8+T 细胞，在免疫位点和动脉粥样硬化斑块中引起树突状细胞的减少［34］。有实验报道，将CD8+T 细胞从p210 免疫的小鼠移植到幼小的非免疫小鼠中，验证了主动免疫的抗动脉粥样硬化作用［35］。

p210可诱导CD8+T和CD4+T细胞反应。通过p210 免疫抑制动脉粥样硬化与CD4+CD25+T 细胞反应有关。注射抗CD25 抗体减少CD4+CD25+T细胞，能降低p210免疫的抗动脉粥样硬化作用［36］。此外，Klingenberg 等［37］用霍乱毒素B 型（cholera toxin B subunit，CTB）融合的p210 组成的重组蛋白对雌性ApoE-/-小鼠鼻腔给药，每周两次。对照组小鼠注射与CTB 或PBS 融合的卵清蛋白肽。实验组的小鼠主动脉窦的动脉粥样硬化减轻。

由p210引起不同的细胞免疫应答可能是由于以下原因：（1）p210 载体形式，用CTB 重组或游离态；（2）递送途径-皮下给药与黏膜给药的差异；（3）p210 的剂量；（4）p210 给药的持续时间。然而，无论以何种形式递送，p210 免疫后动脉粥样硬化的减轻，表明p210是疫苗制剂的候选抗原。

3.2.2 其他ApoB-100 相关抗原 来自肺炎衣原体和热休克蛋白（heat shock proteins，HSP）60 的肽和具有ApoB-100 氨基酸残基688 至707 的肽构成了多抗原组合体，用这种多抗原表位的免疫减少了动脉粥样硬化，且导致巨噬细胞的减少和斑块中的CD4+FoxP3 T 细胞的增加［38］。Kimura 等［39］预测了2 个肽片段，ApoB3501-3516和ApoB978-993，用于免疫的ApoE-/-小鼠时可通过IL-10 依赖性机制减少动脉粥样硬化。

4 动脉粥样硬化疫苗研究中的其他抗原

使用疫苗调节动脉粥样硬化中的免疫应答的方法不仅限于LDL和ApoB-100相关的抗原。动脉粥样硬化血管疾病的复杂性为其他抗原研究提供了可能性。

4.1 胆固醇酯转运蛋白疫苗

胆固醇酯转运蛋白（cholesterol ester transfer protein，CETP）是抗体诱导型动脉粥样硬化疫苗的候选抗原。CETP 是一种酶，可促进胆固醇酯从HDL 转移到LDL，甘油三酸酯从LDL 转移到HDL［40］。体内HDL 浓度与心血管疾病风险呈现负相关［41-42］。使用CETP 肽和破伤风毒素肽（含T 细胞表位）一起进行疫苗接种可增加家兔的HDL 胆固醇水平并减缓动脉粥样硬化进程［54］。但是，CETP 疫苗的Ⅰ期临床试验显示HDL 胆固醇水平与空白组比并无显著性差异［43］。

4.2 其他脂质抗原

天然IgM 抗体可识别凋亡细胞表面的oxLDL表位和磷酰胆碱（Phosphorylcholine，PC）头部基团，并阻止巨噬细胞抑制和oxLDL 凋亡细胞的摄取。抗PC 抗体可用于预防肺炎链球菌感染。LDLR-/-小鼠对肺炎链球菌主动免疫产生了oxLDL 抗体，主要是IgM 同型，并呈现动脉粥样硬化的减轻［44］。oxLDL 特异性IgM 的增加归因于PC 对oxLDL 和肺炎链球菌诱导的抗体的交叉反应，表明肺炎链球菌和oxLDL 之间存在分子模拟特征。一些研究在疫苗的背景下进一步研究和扩展了分子模拟物［45］，该组使用与CpG 寡核苷酸偶联的PC-keyhole血蓝蛋白偶联物作为佐剂并多次对ApoE-/-小鼠腹膜内注射免疫。PC 免疫血清可显著增加抗PC 和oxLDL 的IgG 和IgM 抗体，减少巨噬细胞oxLDL 的摄取，并减轻动脉粥样硬化。

4.3 针对HSP抗原的疫苗

HSP是一种高度保守的应激蛋白，它们在正常条件下存在于细胞中，当细胞暴露于压力条件下（例如pH变化或缺氧）时可以高水平表达。HSP同样影响动脉粥样硬化进程［46］。在最近的一项研究中，该疫苗使用了PBS 缓冲液配制的全蛋白HSP65、DNA 或两者结合进行多次鼻腔用药，所有疫苗制剂均诱导HSP65 IgG 应答，降低胆固醇水平，减少动脉粥样硬化［47］。

4.4 树突细胞疫苗

DCs是最有效的抗原呈递细胞，通过DCs进入宿主的抗原递送可引起有效的免疫反应。有研究者以oxLDL 作为抗原，将细胞静脉注射到新生小鼠中，负载oxLDL 的DCs 的转移诱导产生Th1 应答，增加oxLDL IgG滴度，减少动脉粥样硬化［48］。

4.5 流感疫苗与动脉粥样硬化

有文献报道通过对心血管疾病的患者接种流感疫苗来预防动脉粥样硬化等心血管疾病［49］。调查研究表明，流感季节期间急性心肌梗死和病死率升高，表明心血管疾病与流行性感冒之间存在关联［50］。最近的大数据分析进一步提出了流感疫苗有益于心血管疾病二次保护［51］。这些报告支持进一步研究使用流感疫苗以减少动脉粥样硬化的发生率，并有助于了解其尚未知晓的作用机制。流感疫苗的接种可能减少了动脉粥样硬化斑块中的炎症信号传导，进而减少急性心血管疾病。

5 总结与展望

随着医药科技水平的发展，疫苗消除了许多传染病的感染与影响。同样，为慢性流行的动脉粥样硬化疾病开发疫苗也具有重要意义。本文讨论了特异性和非特异性免疫系统在动脉粥样硬化进程中的双重作用，总结了通过接种疫苗诱导动脉粥样硬化相关抗原特异性免疫反应以及在实验模型中延缓动脉粥样硬化进程的抗原种类。通过自身抗原诱导免疫反应能有效地了解特异性免疫和非特异性免疫对于免疫受体识别和抗体表达的关系，从而为治疗动脉粥样硬化提供指导，并为其他心血管疾病如缺血性心脏病、脑卒中等疾病治疗提供参考。

然而，动脉粥样硬化疫苗的开发仍面临不少挑战。包括：（1）疫苗安全和稳定性的问题，确保疫苗可适当复制天然抗原，并确保免疫反应有适当的强度和质量从而提供有效的机体保护；（2）免疫疗程和持久性；（3）临床研究中的疗效终点的确定和监测；（4）缩短候选疫苗的开发时间、生产和临床应用；（5）成本投入巨大。像所有疫苗一样，动脉粥样硬化疾病疫苗的免疫反应也很难预测，开发出最佳疫苗需要长期耗时的动物疫苗免疫实验，然后表征所得的免疫结果，从而判断疫苗优劣；此外，物种差异造成疫苗的临床使用更加困难，有些疫苗在动物实验中表现良好，但在人体使用却无效（表3）。考虑到所有这些挑战，对动脉粥样硬化疫苗未来临床应用保持谨慎乐观。

表3 部分疫苗临床研究进展

目前，有许多可应用于人体的抗原选择，很多很有希望的结果都是在临床前实验中得到的，将这一疫苗治疗手段运用到临床研究中显得至关重要与紧迫。但将上述临床前观察转化为临床领域仍处于起步阶段，例如，许多临床前试验已经确定LDL 在动脉粥样硬化形成中的作用，这使LDL 和ApoB-100成为免疫调节治疗的初始靶标，但到目前为止，还没有针对此类靶标的药物上市。