外泌体在B细胞恶性肿瘤中的研究进展

粟靖 于健 史明霞

1昆明医科大学第一附属医院血液科，云南省血液病研究中心（昆明650032）；2北京生物医学工程高精尖创新中心，北航生物与医学工程学院（北京100083）

B 细胞恶性肿瘤是一大类血液系统恶性肿瘤，是一个异质性的淋巴细胞增殖性疾病群，包括套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、慢性B 淋巴细胞白血病（B-cell chronic lymphocytic leukemia，B-CLL）、华氏巨球蛋白血症（Waldenstrom′s macroglobulinemia，WM）、弥漫性大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）、多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）、伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）等［1］。近年来，随着利妥昔单抗、BTK 抑制剂等新药的出现，使B 细胞恶性肿瘤的临床治疗取得长足的进步，但由于耐药及其导致的频繁复发，这类恶性肿瘤仍然难以治愈。

肿瘤微环境对B 细胞恶性肿瘤的治疗效果和临床预后有重要影响，其与B 细胞恶性肿瘤之间的信号通讯主要是由细胞之间直接接触、可溶性因子和外泌体介导［2］。近年来，有越来越多的研究表明外泌体介导细胞间信号传递，并证实其在B 细胞恶性肿瘤中的重要作用［3-5］。外泌体是细胞分泌的囊性小泡，平均直径为30 ～100 nm，内含蛋白质、miRNA、mRNA、非编码RNA、脂质等生物活性分子，通常反映其来源细胞的性质和状态［6］。它将细胞内多种蛋白质及遗传物质包裹进入自体中并向细胞外环境中释放，从而向非恶性旁观者细胞传递信息［7］。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）与恶性肿瘤B 细胞分泌大量的外泌体，它们是B 细胞恶性肿瘤微环境的重要组份，有助于肿瘤微环境中细胞之间的信号交流，从而促进肿瘤进展、转移、免疫逃逸和耐药发生［8-13］。

1 外泌体促进B细胞恶性肿瘤的存活和增殖

近年来，已有很多文献报道外泌体可以携带并释放DNA、mRNA、miRNA 和蛋白质到相关细胞［6］。其中外泌体含有的miRNA 已被证明参与多种细胞的信号通路，这些通路对肿瘤的发生和发展至关重要［14］。B-CLL 细胞释放的外泌体含有与疾病相关的mRNA。它们通过将mRNA 转移到非恶性旁观者细胞内对靶细胞进行“重新编程”，从而改变受体细胞的表型来引起细胞微环境的变化，这是B-CLL 发病机制中的一个关键因素［7］。在体外实验中，B-CLL 细胞分泌的外泌体被MSCs积极摄入，通过将蛋白质和miRNA（miR-146a 和miR-451）转移到MSCs 中上调了与MSCs 生长、存活和迁移相关的基因，从而转变成类似于癌症相关的成纤维细胞表型。B-CLL 细胞分泌的外泌体能够激活MSCs 中多种RNA 和蛋白的表达，从而激活蛋白激酶B/细胞外信号调节激酶（protein kinase B/extracellular signal-regulated kinase，Akt/ERK）和NF-κB 等信号途径，最终导致转录因子活性的改变。这些转录因子诱导了IL-8、B 细胞激活因子（B cell activating factor，BAFF）、CXC 趋化因子配体-1（CXC chemokine ligand-1，CXCL1）、IL-6、CC 趋化因子配体-2（CC chemokine ligand-2，CCL2）、CCL5、细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）等细胞因子的释放，促进了MSCs的增殖，增加了MSCs 与B-CLL 细胞之间的黏附，从而为B 细胞恶性肿瘤的生长、进展、转移提供了适宜的条件［15］，这表明B-CLL 细胞来源的外泌体通过调节MSCs 的一些功能来积极促进疾病进展。

随着B 细胞恶性肿瘤进展为侵袭性表型，其来源的外泌体的分泌、组成和功能也会相继发生改变。通过分析惰性和进行性B-CLL患者血浆来源的外泌体，发现这两者之间存在差异蛋白组学特征，S100-A9 蛋白仅存在于进展期B-CLL 患者血浆来源的外泌体中，并且该蛋白在此阶段由白血病细胞特异性过表达。更重要的的是，携带S100-A9蛋白的外泌体能够通过激活B-CLL 细胞中的NF-κB 途径维护白血病细胞的存活、增殖［9］，这表明外泌体是使B-CLL 中NF-κB 信号途径激活的新起源，并强调了外泌体作为细胞外介质在促进B-CLL 进展中的重要性。在一项对MM 的研究中发现，MM 细胞来源的外泌体过表达CD147 可以增强MM 细胞的增殖，同时下调CD147 的表达后从MM 细胞来源的外泌体刺激MM 细胞的增殖能力减弱，这说明携带CD147 的外泌体能够部分诱导MM 细胞的增殖，从而促进MM 的进展［16］。

2 外泌体介导B 细胞恶性肿瘤的迁移

MSCs 分泌的外泌体含有SDF-1、干扰素诱导蛋白-10（interferon induced protein-10，IP-10）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1），这有助于增强MM 细胞迁移。此外，MM 细胞释放的外泌体通过激活ERK1/2 和c-Jun 氨基-末端激酶1/2/3（c-Jun N-terminal kinase1/2/3，JNK1/2/3）途径促进MM 细胞的迁移。用硼替佐米处理外泌体后发现ERK1/2 磷酸化降低，从而有助于抑制MM 细胞的转移［17］。

有研究［18］证实从MM 细胞获得的条件培养基可以上调MSCs 中miR146a 的表达。进一步研究发现，来源于MM 细胞的外泌体含有miR-146a，可以转移到MSCs 中，而在MSCs 中过量表达miR-146a 可导致CXCL1、MCP-1 和CCL-5 等多种趋化因子的分泌增加，从而促进MM 细胞的迁移，这表明携带miR-146a 的外泌体可以促进MM 细胞迁移。此外，内源性Notch 途径的抑制剂DAPT 能够消除miR-146 诱导的MSCs 释放的趋化因子增加，这可能是由于Notch 途径可与NF-κB，JAK 激酶/信号转导和转录激活子（janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）途径相互作用，从而调节趋化因子基因的转录所致。

3 外泌体和B 细胞恶性肿瘤的免疫逃逸

肿瘤发生和发展的一个重要因素是免疫逃逸，外泌体被认为是抑制肿瘤免疫监视的重要参与者［19］。EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）相关的DLBCL 细胞分泌的外泌体包含EBV 来源的非编码RNA，当这些外泌体进入巨噬细胞和单核细胞中，携带的非编码RNA 可以诱导巨噬细胞、单核细胞转变为免疫调节表型来支持肿瘤免疫逃避［4］。NKG2D 是自然杀伤细胞（natural killer cells，NK）的活化型受体，在天然免疫中发挥着重要的作用。它的配体NKG2DL 在多种类型的肿瘤中都有组成性表达，包括B 细胞恶性肿瘤，这表明肿瘤逃离NKG2D/NKG2DL 介导的免疫监视机制可能存在。B细胞恶性肿瘤分泌的外泌体表达和分泌应激诱导的NKG2D配体MICA/B和ULBP1/2的mRNA 和蛋白质。NKG2D 配体作为诱饵，可以下调体外NKG2D 受体介导的细胞毒性，损害NK 细胞功能，从而使表达NKG2D 配体的B 细胞恶性肿瘤逃避免疫监视［20］。

骨髓来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是未成熟的骨髓细胞，作为一种免疫反应的负调节因子，活化后MDSCs 促进肿瘤细胞生长、侵袭，并增强免疫抑制能力［21］。WANG 等［8］在体内和体外研究中均发现MM 细胞来源的外泌体通过激活STAT3 和STAT1 通路以及增加抗凋亡蛋白Bcl-xl 和Mcl-1 的表达来促进MDSCs 的生长。此外，MM 患者来源的外泌体还增强了MDSCs 释放一氧化氮合酶的能力以及对T 细胞的抑制活性，这将进一步促进MM的进展。

4 外泌体介导B 细胞恶性肿瘤的耐药

外泌体在肿瘤耐药过程中具有重要作用，其介导肿瘤细胞耐药的方式主要是通过外泌体途径将药物排出细胞外、中和单克隆抗体药物和通过复杂的miRNA 与mRNA 相互作用调控基因表达［22］。CD20 是一种跨膜磷酸蛋白，由成熟B 细胞以及大多数B-NHL 细胞表达。利妥昔单抗是第一代抗CD20 抗体，由美国食品和药物管理局于1997年批准的第一种抗癌抗体［23］。恶性淋巴瘤B细胞释放的外泌体携带CD20，可以中和利妥昔单抗，保护靶细胞免受特异性抗体攻击，从而阻碍利妥昔单抗诱导淋巴瘤B 细胞的凋亡［24］。

据报道，在复发/难治性MM 患者中分离出的原代MM 细胞中，miR-15a 的表达水平低于正常细胞。进一步研究发现，通过在MM 细胞中过表达miR-15a 可以抑制肿瘤细胞的增殖，这表明miR-15a 具有肿瘤抑制特性。有趣的是，原发性MM 来源的MSCs 分泌的外泌体与MM 细胞分泌的外泌体具有相似之处，都表达较低水平的miR-15a，但致癌蛋白和生长因子的含量较高，在进入MM 细胞后有助于促进肿瘤细胞的耐药［25］。MSCs 分泌的外泌体通过与B-CLL 细胞相互作用不仅使BCLL 细胞迁移能力增强，而且还促使B 细胞受体（B-cell receptor，BCR）途径的基因如CCL3/4，早期生长反应因子1/2/3（early growth response factor1/2/3，EGR1/2/3）和MYC 上调，从而保护B-CLL 细胞的自发性凋亡，并在进入B-CLL 细胞后降低B-CLL细胞对氟达拉滨、依鲁替尼、idelalisib 和venetoclax的药物敏感性［10］。体内和体外实验结果均已证明MSCs 来源的外泌体通过激活一些生存相关的信号通路，包括JNK、p38、p53 和Akt，促进了MM 细胞的生存、增殖、存活、迁移，并诱导MM 细胞对硼替佐米耐药，这些发现为进一步探索靶向这些外泌体的方法提供了依据。ZHANG 等［26］发现对硼替佐米耐药的患者释放的外泌体中miRNA 水平明显下调，例如miR-16-5p，miR-15a-5p，miR-20a-5p和miR-17-5p，其中MM 细胞中miR-15a-5p 和miR-16-5p 的下调可能是通过miRNA 与mRNA 相互作用调节肿瘤微环境来促进MM 细胞的耐药。

5 外泌体在B 细胞恶性肿瘤诊断和治疗中的潜在应用

5.1 作为B 细胞恶性肿瘤诊断的工具B-CLL 患者的外泌体总量与晚期临床分期呈正相关，可以用来预测总生存期（overall survival，OS）。此外，B-CLL 患者血清来源的外泌体主要表面抗原有CD19+和CD37+，可以作为B-CLL 的生物标记［27］。Richter 综合征（richter syndrome，RS）是指在B-CLL的基础上已发展为侵袭性淋巴瘤，且预后不良［3］。通过识别携带miR-19b 的外泌体可以潜在的预测B-CLL 向RS 的演变，这样就可以在经典症状出现前诊断RS。miR-19b 起作用的机制主要是上调Ki67 和下调p53。这表明携带miR-19b 的外泌体可以作为B-CLL 进展到Richter 综合征的细胞标志物［3］。在一项对WM 研究中，发现无症状和有症状的WM 患者来源的外泌体中具有类似水平的miRNA，这表明在症状出现之前，在疾病进展的早期阶段就已经发生外泌体内miRNA 的变化。此外，有小部分外泌体内miRNA 的表达与WM 患者的疾病状态正相关或负相关，包括抑癌基因miRNA let-7d、癌基因miR-21 和癌基因miR-192［28］。IACCINO 等［29］证实MM 细胞释放的外泌体表达肿瘤B 细胞的免疫球蛋白B 细胞受体（immunoglobulin B-cell receptor，Ig-BCR），它可以被独特型结合肽（idiotype-binding peptides，ID-肽）靶向结合。这表明ID-肽识别MM 细胞释放的外泌体可以作为诊断和评估MM 疾病进展的一种方法。

5.2 作为纳米载体用于B 细胞恶性肿瘤的治疗外泌体在细胞通讯过程中可以保护货物免受核酸酶和蛋白酶侵害，具有低免疫原性和细胞毒性，并且还有特异性靶向肿瘤细胞的能力，因此被视为分子信号、药物递送和基因水平转移的理想载体［30］。MCL 患者的外泌体能够被健康人和患者的B 淋巴细胞摄取，而T 淋巴细胞和NK 细胞没有明显摄取［31］，这表明了MCL 来源的外泌体对B 淋巴细胞具有天然特异性，可以作为治疗B 细胞恶性肿瘤的理想载体。外泌体能够有效地装载siRNA，并有效调控靶基因，这对肿瘤的发生和发展起着重要的作用。LUNAVAT 等［32］证实含有针对c-Myc 的siRNA 的外泌体不仅可以下调c-Myc 的转录和翻译，还可以通过激活细胞凋亡途径诱导小鼠淋巴瘤细胞凋亡。

5.3 参与B 细胞恶性肿瘤的免疫治疗CD40/IL-4刺激的B-CLL 细胞释放的外泌体含有丰富的miR-363。携带miR-363 的外泌体可以进入CD4+T 细胞内，靶向免疫调节分子CD69，增强CD4+T 细胞的增殖、免疫突触活性和迁移。进一步研究发现，在CD40/IL-4 刺激前通过敲除B-CLL 细胞中的miR-363，阻止了B-CLL 细胞释放的外泌体诱导增加免疫突触信号的能力，也赋予了CD4+T 细胞功能改变的特异性。这说明携带miR-363 的B-CLL 细胞释放的外泌体对B-CLL 细胞具有免疫调节作用，可以用作B-CLL 细胞免疫治疗的载体［33］。此外，BL细胞来源的外泌体含有参与抗原呈递、细胞迁移和细胞黏附的蛋白质，并携带了肿瘤表面抗原，例如CD19，CD20 和CD22［11］。这表明BL 细胞来源的外泌体可以诱导肿瘤抗原特异性的抗肿瘤免疫，因此可能是淋巴瘤细胞相关抗原免疫治疗的潜在来源。由于天然的外泌体存在复杂而多变的生物活性分子，这将影响它们对分子货物的可接受性。一种潜在的替代方案已被开发，那就是使用可控的程序进行组装外泌体，从而将其用于功能蛋白的定向转 移。GARTNER 等［34］设计 了 一种 携 带gp350、CD40L 和人类巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）的免疫显性抗原（pp65）的外泌体。这种外泌体可以与B-CLL 患者的恶性B 细胞特异性相互作用，并使这些细胞对EBV 和CMV 特异性CD4+T和CD8+T细胞具有免疫原性。这表明CD40L+/gp350+/pp65+的外泌体具有免疫治疗B细胞恶性肿瘤的潜力。

5.4 基于外泌体的B 细胞恶性肿瘤疫苗目前，肿瘤来源的外泌体普遍含有肿瘤抗原，因此将其作为疫苗的潜在用途受到广泛关注。肿瘤来源的热休克蛋白（heat shock protein 70，HSP70）分子是分子伴侣，已经被用作癌症疫苗中的佐剂，有助于刺激树突状细胞（dendritic cells，DC）细胞成熟和增强CD8+细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）免疫应答［35］。XIE 等［36］证实表达膜结合HSP70 的MM 细胞释放外泌体能够通过上调共刺激分子（CD40 和CD80）和炎性细胞因子（IL-1、肿瘤坏死因子-α和IL-12）来促进DC 的成熟，并且增强的CD8+CTL 细胞的抗肿瘤免疫能力。这表明表达膜结合HSP70 的肿瘤细胞释放的外泌体可能代表了一种更有效的基于外泌体的疫苗，用于诱导抗肿瘤免疫。

5.5 通过减少外泌体的释放来治疗B 细胞恶性肿瘤由于B 细胞恶性肿瘤来源的外泌体可以促进免疫逃逸，并在肿瘤微环境中直接或间接的支持肿瘤细胞，因此如何阻断这些外泌体的分泌，或将其从患者体内清除肿瘤细胞来源的外泌体可能有助于抑制肿瘤进展。FAICT 等［37］发现MM 细胞来源的外泌体不仅在体内增强了破骨细胞的活性，还在体外阻断了成骨细胞的分化和功能。鞘磷脂酶抑制剂GW4869 在体内阻断外泌体的分泌不仅可以减少骨溶解，而且与硼替佐米联合使用还具有显著的抗肿瘤作用，这说明抑制外泌体的分泌可能是MM 新的治疗靶点。

6 结语

目前研究主要集中于外泌体在B-CLL 和MM疾病中的潜在应用，对于外泌体在其他B 细胞恶性肿瘤的研究仍然甚少，且外泌体内生物活性成分以及发挥作用的机制仍需要进一步探讨。由于外泌体的生理性质和功能，可把它作为分子信号、药物递送和基因水平转移治疗B 细胞恶性肿瘤的理想非细胞载体。在优化B 细胞恶性肿瘤疗效的同时，可以减少其非靶向递送。因此，进一步广泛开展研究评估基于外泌体的免疫治疗或基因修饰后外泌体的长期安全性和有效性，利用基因修饰后的外泌体特异性地传递抗B 细胞恶性肿瘤信号杀伤肿瘤细胞，将可能进一步改善抗B 细胞恶性肿瘤的治疗效果，但将这些策略转化为临床实践仍面临着巨大的挑战，例如外泌体的安全性、复杂多变性、稳定性、精确靶向性等。通过对外泌体这一领域进一步研究，无疑将对B 细胞恶性肿瘤与其肿瘤微环境之间的相互作用产生更多深入的了解，这将为治疗B 细胞恶性肿瘤提供了潜在的理论基础。