Spred蛋白及其相关miRNA研究进展

龚坚 刘巧

1江西中医药大学（南昌330004）；2江西中医药大学第二附属医院（南昌330012）

Spred 家族是一组Sprouty 相关的酪氨酸激酶结合蛋白，目前哺乳动物中有Spred-1、Spred-2、Spred-3 和Eve-3 四个家族成员，广泛存在各种生物组织中；其家族成员主要由N 末端的EVH1（Enabled/VASP homology-1），中部的KBD（Thec-Kit bindingdomain）和C 末端的SPR（Sprouty-relateddomain）三个结构域组成，不同结构域影响不同的生物学功能［1-3］。Sped 蛋白对多种生长因子诱导的Ras-ERK 信号途径有负调控作用，参与肿瘤的转移、血管增生修复、免疫调节等生理病理过程。microRNA（miRNA）是一种非编码性单链小分子RNA，广泛存在于生物细胞中，可与靶基因mRNA的3′非编码区（3′-UTR）结合形成沉默复合体，然后导致靶基因mRNA 降解或抑制靶基因的翻译，进而调控靶基因的表达；与细胞增殖、分化、器官形成以及免疫应答过程等都息息相关［4］。研究表明，Spred 是多种miRNA 的靶蛋白，它们能通过调节Spred 蛋白表达，参与多种疾病进程中。本文就近年Spred 蛋白及其相关miRNA 研究进展作一综述。

1 Spred 蛋白信号传导及生物学功能

1.1 Spred蛋白与Ras/MAPK信号通路Ras/MAPK信号通路在细胞信号转导过程中起着极为重要的作用。WAKIOKA 等［1］通过细胞实验首次证明Spred 蛋白家族对于Ras/MAPK 信号通路抑制作用，但是其具体结合靶分子尚不明确；随着近年对Spred 蛋白研究的增多，越来越多的证据表明Spred蛋白家族是Ras/MAPK 信号通路抑制剂；在细胞表面整合素、FGF 受体、细胞因子受体等酪氨酸激酶受体受到刺激后，胞内蛋白质如SHC、GRB2 和SHP2 被激活并募集细胞质中SOS，后者促使GDPRas 转化为GTP-Ras，即RAS 蛋白被磷酸化激活；GTP-Ras 募集Raf-1 激酶并使Raf-1 磷酸化，后者进而激活Erk 等在内的下游蛋白［5］；在这一过程中Spred 能特异性地增强激活的Ras 和Raf 之间的相互作用，形成复合体，抑制Raf 活化，继而抑制下游通路的激活［1］。

1.2 Spred 蛋白生物学功能Erk1/2 激酶活化是T 细胞中几种生长因子的信号级联中的关键事件，它也是在T 细胞受体（TCR）信号传导途径，导致T 细胞的活化和增殖的下游事件；肿瘤微环境中高水平的TGF-β可导致上游TCR 信号传导组分的下调，同时伴随着Spred-1 的上调，这些结果导致Erk途径的抑制，从而导致肿瘤浸润性CD8+T 细胞的增殖/细胞因子产生受损，可见Spred 蛋白与肿瘤细胞免疫抑制密切相关［6］。在对Spred-2 KO 小鼠研究中发现，该类小鼠表现出学习缺陷、抑郁以及类似强迫症行为，如皮肤敏感、强迫性自我修饰等，进一步研究表明Spred-2 缺乏导致小鼠杏仁核中原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）、Ras 和Erk 活性的增加介导了通路的过度激活诱发，并且该途径失调会导致突触前、后mRNA 和蛋白质的变化以及丘脑-杏仁核传递的改变；这一结果表明，Spred-2 可能是不同大脑区域突出传递的关键调节剂［7］。心脏功能取决于平衡的蛋白质更新，因此，调节蛋白衰减对于维持心脏功能至关重要。研究表明，Spred-2-/-小鼠表现出心肌细胞肥大，心脏纤维化，电兴奋性受损和严重的心律失常。其机制可能是Spred-2 缺失，导致心肌细胞中自噬相关介质失调及Erk 过度活化，继而引起心肌细胞功能异常，最终导致心脏功能障碍；由此可见Spred-2 参与心肌细胞自噬功能及调节心脏功能的过程［8］。除上述生物学功能外，近年研究表明Spred 蛋白还参与了肿瘤细胞增殖、分化，肿瘤侵袭、转移，血管增生及修复，细胞自噬，肺脏发育，骨生长，淋巴管生成等多种生理病理过程。

2 Spred-1 蛋白与miRNA

研究表明，在小鼠胚胎中，Spred-1 蛋白在心、肝、肺、脑组织有强表达，说明Spred-1 对胚胎发育有重要作用；而在成熟小鼠中Spred-1 蛋白主要在大脑中表达最强，小鼠肺、心脏、肝、肾、肠、脾、睾丸、胸腺和卵巢等组织中也能观察到Spred-1 的表达，进一步研究发现Spred-1 与这些脏器的多种疾病密切相关［9］。miRNA 作为非编码RNA，在对研究发病机制愈发重要，而其具体机制尚不完全清楚。目前发现，多种miRNA 调控因子通过调控Spred-1 蛋白，继而参与的疾病的发生发展。

2.1 miR-126miR-126 是由表皮生长因子样结构域7（EGFL7）基因的内含子7 编码的miRNA，主要在血管内皮细胞（EC）中表达，包含miR-126-3p和miR-126-5p 两条成熟链［10-11］。EC 表达的miR-126 可以激活VEGF 依赖的信号通路并促进血管生成及调节血管完整性，在这一过程中Spred-1 作为miR-126-3p 靶蛋白发挥重要作用［12-13］；因此，miR-126 通过调节Spred-1 蛋白参与和血管增生、修复等相关疾病，如心脑血管疾病、肿瘤、肺部疾病、糖尿病血管病变、眼部血管相关疾病等。

在心肌梗死老鼠模型的研究中发现，心肌梗死老鼠心肌组织中miR-126 表达明显降低，但通过丹参红注射液干预治疗后miR-126 表达升高，同时抑制了Spred-1 表达，并激活了ERK 途径，促进了血管生成作用，达到修复心肌的作用［14］。缺血性卒中是全世界死亡和残疾的主要原因之一，血管生成被认为是缺血性中风后修复和重塑的有希望的疗法［15］。miRNA 分析研究揭示miR-126 在年轻卒中患者中下调［16］；而在短暂性脑缺血发作（TIA）的研究中发现，在TIA 发病3 h 内miR-126 开始下降，到12 h 显著低于健康人，而Spred 则相反，二者呈现明显时间相关性；进一步实验发现，TIA发作后随时间延长外周血（VEGF）浓度逐渐升高，这些结果提示在TIA 中miR-126 调控Spred-1 表达参与VEGF 信号通路对内皮细胞及血管修复中［17］。病理性视网膜新生血管（RNV）是眼科疾病视力丧失的主要原因之一，而研究表明miR-126 和Spred-1可能作为治疗RNV 相关眼病的新型分子靶标，其机制是在RNV 的发展过程miR-126 可通过抑制Spred-1 表达来促进诱导性多功能干细胞（IPS 细胞）中VEGF 的表达，进而有助于血管生成［18］。有研究表明，miR-126、Spred-1 参与白血病、肝癌、胃癌、肺癌、胶质瘤等多种肿瘤的发生；如在经导管动脉化疗栓塞（TACE）后肝细胞癌（HCC）模型中，通过抑制miR-126 的表达水平促进Spred-1 的表达，可抑制VEGF 通路调节TACE 后HCC 患者血管生成［19］；可见miR-126、Spred-1 在肿瘤发生及治疗中均重要作用。

2.2 miR-212 及miR-132/212miR-212 和miR-132 基因以相同的结果存在于生物组织，与神经功能、肿瘤、免疫调节等功能密切相关［20］。研究发现，大鼠纹状体中的miR-212 在接触可卡因10 d 后开始增加，并持续存在；其机制可能是miR-212 介导的Spred-1 表达抑制进而促进Raf-1 激活扩增CREB 信号，从而调节可卡因摄入的效应［21-22］。在miRNA-132/212 KO 的股动脉闭塞动物模型的研究中发现灌注恢复现象，说明miR-132/212 参与该模型动脉生成过程，而进一步实验表明，miR-132/212簇是通过直接靶向其抑制剂Rasa1 和Spred-1 调节Ras-MAPK 信号传导来促进动脉发生［23］。以上研究表明，Spred-1 是miR-212 及miR-132/212 参与药物成瘾及动脉发生的重要调控因子。

2.3 miR-196amiR-196a 是由HOX 家族基因转录而来，不仅参与调节脂肪分布、干细胞细胞分化等生物学过程，而且还在食管癌、乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌等肿瘤的发生发展中发挥类似癌基因的功能［24］；国内学者在对乳腺癌研究中发现，Spred-1 是miR-196 的直接靶标，它通过抑制c-Raf 信号通路在miR-196a 促进BC 细胞增殖，迁移和侵袭中发挥关键作用；进一步实验发现，雌激素受体（ER）可调控的miR-196a，进而调节Spred-1 蛋白表达，最后影响肿瘤生长和血管生成；结果表明，miR-196a 及其靶标Spred-1 在雌激素介导的乳腺癌进展中发挥重要作用，这可能有助于为乳腺癌提供新的治疗靶点［25］。

2.4 其他除上述miRNA 外，miR-1、miR-21、miR-144、miR-182、miR-206、miR-409 均能靶向Spred-1 蛋白表达，参与疾病发生。研究表明，miR-1 是心肌梗死早期敏感标志物；当心肌梗死发生后，miR-1 表达升高促使人类来源的心肌细胞祖细胞（hCMPCs）被诱导分化为内皮细胞和平滑肌样细胞，从而在体外形成血管网络，帮助完成心肌梗塞后心肌修复；在这过程中过表达的miR-1 抑制Spred-1 表达，从而减轻Spred-1 对由促血管生成生长因子激活的细胞内信号级联反应的抑制作用，进而完成血管重建工作；可见miR-1 在心肌梗死早期及后期修复中均有重要作用［26-27］。miR-144、miR-182、miR-206/21 在调节各种癌症中的细胞增殖，克隆形成，迁移，侵袭和肿瘤形成中起重要作用；SHARMA等［28］研究发现Spred-1 是miR-144新的靶标，在69%食道癌（EC）组织中下调，而且65%的食管癌组织中观察到Spred-1 mRNA 水平与miR-144表达呈负相关；而在恶性口腔癌组织中，通过持续上调miR-182抑制Spred-1表达，促使Ras/Raf/Erk信号传导激活并促进癌细胞增殖［29-30］。在三阴性乳腺癌细胞中，miR-206/21 协作通过抑制RASA1和Spred-1 的翻译来促进RAS-Erk 信号传导和相应的细胞表型表达［31］。郑剑等［32］通过对三氯乙烯药疹样皮炎（OMLDT）患者血清研究发现，miR-409 在OMLDT 患者中具有差异表达，其可能靶向调节Spred-1 的表达，通过下调MAPK 信号通路，造成三氯乙烯药疹样皮炎患者的肝损伤。

3 Spred-2 蛋白与miRNA

Spred-2 蛋白在人体各种组织及成熟大鼠的各种组织中广泛表达，包括消化道、肺、肾和肝［33］；在疾病研究中，组织广泛表达的Spred-2 蛋白正作为多种miRNA 的调控靶标备受重视。

3.1 miRNA-487amiR-487a 定位于14 号染色体，在调节癌症迁移中起作用；有报道其参与乳腺癌［34］、前列腺癌［35］等肿瘤发生。而在肝细胞癌中，CHANG 等［36］研究发现，Spred-2 是miR-487a 的直接靶标，并且miR-487a 可通过与Spred-2 mRNA 的30-UTR 的2527-2549 位点和2575-2597 位点结合来抑制Spred-2 表达；进一步实验表明，上调miR-487a通过调节HCC 细胞中miR-487a 介导的MAPK 信号传导促进肝癌细胞转移；说明miR-487a 和Spred-2可成为肝细胞癌的潜在治疗靶点。

3.2 miR-210miR-210 是一种由HIF-1α调节的缺氧反应性microRNA，广泛参与血管生成、肿瘤发生等生理病理过程［37-38］；Spred-2 是其50 余个靶基因中之一，被认为是miR-210 参与颈动脉粥样硬化、中风和胃肠道肿瘤调控靶基因。氧化低密度脂蛋白（oxLDL）是导致心血管疾病（CVD）和消化道肿瘤的常见致病因素，研究发现，oxLDL 诱导的miR-210 可以增 强Spred-2/ERK/c-Fos/MMP 信号传导，继而参与肿瘤细胞增殖和迁移；而使用异种移植小鼠模型和喂食高脂肪饮食的ApoE KO 小鼠的动物研究进一步支持了oxLDL、miR-210、Spred-2与肿瘤、动脉粥样硬化、中风的关系［39］。

3.3 其他Spred-2 是miR-1246、miR-221 和miR-485-3p 靶基因之一，但在不同疾病中表达。在一项结直肠癌的实验研究中抗癌基因Spred-2 被鉴定为miR-1246 的下游靶标，而进一步实验发现，类甲基转移酶3（METTL3）可以甲基化pri-miR-1246，促进pri-miR-1246 的成熟，进而通过MAPK 通路促进体内外肿瘤细胞的转移活动，这一发现为肿瘤提供了新的治疗靶点［40］。在小儿哮喘和其他不同的哮喘表型中，多种miRNA 表达失调，其中miRNA-221 和miRNA-485-3p 表达上调，Spred-2 蛋白水平表达下调［41］；而研究表明，在小儿哮喘及哮喘小鼠模型中，Spred-2 是miRNA-221 和miRNA-485-3p 的预测靶标，上调miRNA-221 和miRNA-485-3p抑制Spred-2 mRNA 表达，继而参与过敏原诱导的气道炎症和高反应性［42］。由此可见，多miRNA 调控的Spred-2 在疾病发生、发展中有重要作用。

4 Spred-1/2 蛋白与miRNA

Spred-1、Spred-2 可共同表达于多种动物组织及人体组织中，如肺、脑等组织中，部分miRNA 能通过调控这两种蛋白参与疾病进程中。有研究表明，Spred-1、Spred-2 均是miR-31 靶蛋白；在对在人和小鼠肺癌的实验研究中发现，miR-31 表达增加，而miR-31 的4 种靶蛋白Spred-1、Spred-2、RASA1 和SPRY4 减少，且前后者之间存在显著的负相关，其机制可能是miR-31 升高抑制Spred-1、Spred-2 表达，继而导致Erk 活化增加，导致肺肿瘤细胞增殖增加；这种情况在肺腺癌中更突出［43-44］。同样，在表皮修复过程中，miR-31 通过靶向Spred-1、Spred-2等Ras/MAPK 信号通路的负调控因子从而激活Ras/MAPK 信号通路，继而通过该通路完成伤口周围细胞增殖和细胞迁移，加快损伤组织的修复［45］；由此可见miR-31 通过靶向Spred-1、Spred-2 参与部分疾病。

5 结语与展望

综上所述，部分miRNA 通过调控Spred 蛋白表达参与肿瘤细胞增殖、转移，血管增生修复，气道炎症及高反应性，损伤组织修复等等病理生理过程，进而参与多种疾病发生发展。随着探索的深入，相信会有更多的miRNAs 被证明在疾病中调节Spred 蛋白的表达，这对于完善miRNA 参与疾病发生的机制大有裨益。目前，在多基因、多miRNA、网络式立体的研究疾病的现在，Spred 蛋白及其相关miRNA 的基础研究取得了一定成果，特别是在肿瘤及心脑血管疾病方面，然而少有基础研究上的临床研究及应用研究；因此，如何探索、建立Spred 蛋白及其相关miRNA 对疾病调控网络的研究以及在优势病种方面的临床研究及成果转化应是下一步研究方向。