甲状腺癌相关基因和RNA分子标志物的研究现况

刘颖，刘阁玲

(华北理工大学附属唐山市工人医院内分泌一科，河北 唐山)

0 引言

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，约占全球所有癌症的2.1%，其中约77%的病例发生在女性[1]。甲状腺癌是美国女性中第五大最常见的癌症，据估计2015年男女新发病例超过62 000例[2]。全世界甲状腺癌的发病率持续上升，但死亡率增长不明显，大多数甲状腺癌患者具有良好的自然病史[3]。根据组织病理学特征，甲状腺癌可分为四种主要类型：甲状腺乳头状癌(PTC)、滤泡性甲状腺癌(FTC)、髓样甲状腺癌(MTC)和间变性甲状腺癌(ATC)。PTC占甲状腺癌的70-80%，是TCs的主要组织学类型。对于甲状腺癌是否需要早期诊断和治疗是目前临床讨论的热点，并且有很多不一致的观点。

由美国临床内分泌医师协会(AACE)，美国内分泌学院(ACE)和美国医学内分泌协会(AME)联合制定了甲状腺结节诊断和管理的临床实践指南，目前在2016年更新的指南中指出[4]，在高达50%-60%的健康体检者中可发现甲状腺结节，大多数甲状腺结节并不会引起明显的临床症状，对于这部分结节的处理最主要的问题就是区分结节的良恶性，超声检查(US)和细针穿刺活检(FNA)是诊断的甲状腺结节良恶性的基石。指南中推荐所有有明显甲状腺结节或临床危险因素的患者均应行超声检查。影像学和细针穿刺活检技术的日益普及和发展，为发现和诊断隐匿的、比较小的、原本无法通过症状或触诊发现的甲状腺癌提供了更多的机会。甲状腺癌的第一步诊断依赖于FNAB，其中约有25%的结节良恶性不能确定，对于不确定良恶性的结节可进行重复穿刺或诊断性手术[5]。在2015年的ATA指南中提出[1]，建议对甲状腺结节和分化型甲状腺癌患者的诊断、评估和治疗采取更加谨慎的方法。分子检测目前被讨论作为超声引导下细针穿刺活检技术的辅助手段，当细胞学对甲状腺结节的性质不确定的情况下，可以更好地分流恶性肿瘤的风险，从而潜在地减少诊断性手术的发生率。

因此发现新的诊断方法和新的生物学标记物是甲状腺结节诊断中的日益增长的需求，并可以消除不必要的重复FNABs和外科手术。近年来，在了解甲状腺癌的发生和关于其分子标志物的研究上取得了很大的进步。分子生物标志物包括编码和非编码 RNA，在多种疾病中发挥重要作用，并已被用作辅助诊断工具。在甲状腺癌中包括基因突变、蛋白和mRNA标志物如 BRAF、RAS 和半乳凝素3等已被用于改善患者甲状腺结节诊断准确性[6]。本文将概述近几年的在甲状腺癌诊疗方面有进展和研究热门的基因生物标志物。

1 甲状腺癌相关经典基因分子标记物

已在人类乳头状甲状腺癌(PTC)中鉴定出四种癌基因的遗传学改变，即RAS点突变，RET重排(RET/PTC)，NTRK1重排(TRK)和BRAF点突变。这些癌基因沿着RET/PTC(TRK)-RAS-BRAF-MEK-MAPK激酶途径起作用，介导许多细胞的生长、凋亡，包括甲状腺细胞的生长，增殖和存活[6]。

1.1 BRAF基因突变

BRAF是分化型甲状腺癌(DTC)中最常见的突变基因类型，而BRAF V600E基因突变在PTC中被认为是最常见的基因事件，且BRAF V600E突变在PTC具有特异性[7]。约有一半的PTC患者中存在该基因的突变[8]。BRAF V600E基因突变的检测可以减少由于细针穿刺细胞学检查结果良性而对乳头状甲状腺癌的漏诊，Chen X[9]等人建议对于≥2个可疑超声特征的高危甲状腺结节，应常规进行细针穿刺并进行BRAF V600E突变检测。既往大量研究已证实，BRAF V600E突变与肿瘤更高的侵袭性和更高的术后复发风险密切相关，与PTC预后不良之间呈正相关。BRAF V600E突变分析不仅可以用于PTC的诊断，而且可以预测其预后[10]。Wang F[11]等人回顾了六个国家11个研究中心的2638例患者中BRAF状况与男性性别与PTC临床病理结果(尤其是死亡率)之间的关系研究认为，男性是导致BRAF V600E患者PTC特异性死亡的有力独立危险因素。Mathur A[12]等人所在的机构中，BRAF V600E突变率在15年内显着增加，研究者认为随着时间的推移乳头状甲状腺癌的BRAF突变率更高，BRAF突变率增高可能与甲状腺癌的发病率增加相关。

1.2 RAS基因突变

RAS基因突变是甲状腺癌中仅次于BRAF的常见突变类型[13]。既往很多临床医生都已经认可RAS突变提示恶性肿瘤的发生。尽管一些资料显示RAS基因突变可能会增加恶性肿瘤风险，但大多数RAS阳性的甲状腺癌都有低风险表型。细胞学良性而RAS突变阳性的甲状腺结节可以多年处于不活跃状态[14]。最近的研究发现[15]：RAS阳性的甲状腺结节通常具有不确定的细胞学特征，而且RAS阳性突变的发现可以识别出大量良性病变以及甲状腺癌。最新报道的一项前瞻性研究[16]，对术前的细针穿刺活检时发现携带RAS突变的结节进行前瞻性地追踪，其中80例RAS阳性结节中有56例进行了手术，其中33例(58.9%)被确认为良性，7例(12.5%)是具有乳头状核特征(NIFTP)的非侵入性甲状腺滤泡性肿瘤，16例(28.6%)是甲状腺癌。所以RAS突变单独发生时，不能用于识别Bethesda III / IV细胞学类型的恶性肿瘤，但可以预测肿瘤的良性行为。

1.3 TERT启动子突变

在许多人类恶性肿瘤中发现了刺激TERT转录和端粒酶激活的TERT启动子突变，其中最常见的TERT启动子突变是C228T和C250T。2013年在甲状腺癌中发现端粒酶逆转录酶(TERT)启动子突变[17]。此后在此方面的研究取得了许多进展。Melo M[18]等人对204位患者的437个组织样本进行了突变分析，主要是甲状腺乳头状癌(PTCs；n=180)，所有标本中包括196位有淋巴结转移和56位远处转移。发现端粒酶逆转录酶启动子(TERTp)在原发性PTC，淋巴结转移和远处转移中突变频率分别为：12.9%，10.5%和52.4%；远处转移显示TERTp突变丰富，表明TERTp突变可能在远处转移中起作用。在一项纳入了13项研究收集了4347例PTC患者的mate分析研究[19]，端粒酶逆转录酶(TERT)启动子突变与BRAFV600E突变具有协同关联，并且验证基因二重性在甲状腺乳头状癌中的作用，两个基因突变的共存与高风险临床病理特征的关系远比单独一个基因的突变作用更强。有研究表明[20]，TERT启动子突变的存在与分化型甲状腺癌患者死亡率的增加独立相关。也有研究[21]发现BRAFV600E和TERT启动子突变可以共存于甲状腺乳头状癌(PTC)中。BRAFV600E和TERT启动子突变基因二重体被认为与PTC的侵袭性有关，而且遗传二重性与更高的死亡率相关联。TERT启动子突变的发现代表了甲状腺癌中一个重要的新致癌基因，并且该突变有望成为甲状腺癌的新的诊断和预后遗传标记，与BRAFV600E突变或其他遗传标记(例如RAS突变)结合使用可证明在临床上对甲状腺癌的治疗有作用[22]。

2 甲状腺癌相关RNA分子标志物

有研究表明mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA可与竞争性内源性RNA(ceRNA)相互作用，形成ceRNA调控网络，在肿瘤发生、发展过程起一定的作用。

2.1 miRNA与甲状腺癌

近年来，针对分子标记物的研究日益成为研究热点，而其中以针对miRNA的研究较为集中。越来越多的研究证实miRNA在各类甲状腺癌的发生发展、辅助诊断、治疗以及预后等各方面都可作为重要的分子标志物。miRNA被认为是甲状腺癌最具潜能的新型生物学标志物之一[23]。

MicroRNA (miRNA)是一种高度保守的单链小分子非编码RNA，约21～23bp，具有转录后调控基因表达的功能[24]。microRNA通过与mRNA互补结合抑制蛋白翻译或导致mRNA降解，干扰mRNA指导蛋白合成过程，从而负向调节蛋白编码基因的表达[25]。功能研究已经证实，许多癌症的发生与miRNA失调相关，miRNA充当原癌基因或抑癌基因的作用[26]。miRNA的异常表达调节肿瘤细胞生长、增殖和凋亡等。与正常甲状腺组织相比，miRNA221，miRNA222[27]和miRNA146b[28]在PTC组织中高表达在之前已经被证实，而Pamedytyte[29]等人研究证明 miR-146b，miR-222，miR-21和miR-221的较高水平表达与PTC患者初始手术时的肿瘤大小和淋巴结转移有关。据相关研究证明miR-146b失调与PTC的侵袭性以及预后相关。miR-146b在乳头状甲状腺癌中高表达，具有高风险特征，包括甲状腺外侵袭和BRAF(V600E)突变[28,30]。Perdas[31]等人研究发现miRNAlet-7可以降低RAS水平，在PTC中起抑癌基因的作用。而且发现循环中的miRNAlet-7家族基因表达谱可用作PTC的新型非侵入性诊断、预后、治疗和监视标记。最新研究证明与相关的非癌组织相比，PTC肿瘤组织中的miR-188-5p下调，miR-188-5p过表达抑制PTC 癌细胞增殖，主要通过沉默miR-188-5p相关的成纤维细胞生长因子5(FGF5)[32]。根据最近报道的，在PTC组织中表达明显降低的miRNA还有miR-451a[33]。You[34]等人检测了PTC组织和细胞中miR-203的表达情况，并通过细胞实验验证，上调TPC-1细胞和K1细胞的miR-203可抑制上皮-间质转化(EMT)，侵袭，增殖和迁移。在最近的荟萃分析中[35]，Xu等人总结了包括9篇文章中的35项研究，在纳入的文献中，表达上调的循环miRNA主要有let-7e、miR-151-5p、miR-222、miR-190、miR-146b、miR-155、miR-25-3p、miR-451a、miR-124-3p、miR-9-3p、miR-221、miR-21；表达下调的主要有miR-29b、miR-95、miR-579、miR-196b-5p、miR-663。Xu等人评估在663份血清或血浆样本中检测循环miRNA用于甲状腺癌的诊断特征。得出结论认为循环中的miRNA对甲状腺癌的诊断和鉴别甲状腺癌与甲状腺良性结节(BTN)有较好的价值，循环miR-222和miR-146b可能有潜力成为鉴别TC和BTN的诊断工具。

2.2 lncRNA在甲状腺癌中的研究

lncRNAs是指长度超过200个核苷酸，大小在200 bp到100 kb之间的RNA分子[36]。根据定义，lncRNAs不编码蛋白质，它们通常比mRNA短，因为它们的外显子较少。既往研究已证明，lncRNA表达异常在癌症的发生和进展中起作用。lncRNAs 在细胞周期调节中包括细胞分化、增殖、迁移、侵袭和凋亡中均可发挥作用。Wei Lu[37]等人从TCGA数据库中下载了甲状腺癌和正常甲状腺组织的RNA测序数据，从GEO数据库下载了公开的甲状腺癌RNA测序和lncRNA芯片数据(GSE83520、GSE66783、GSE103254)。并进一步对数据库中的lncRNAs进行差异分析，结果显示，在甲状腺癌组织中有数千个lncRNA差异表达，这可能是诊断甲状腺癌的潜在有用的生物标志物。Wei Lu等人为验证分析结果，选择了lncRNA LINC00704(也称为MANCR)进行实验验证，将LINC00704转染到甲状腺癌细胞BHT101和BCPAP中，研究表明下调LINC00704会损害甲状腺细胞的增殖，抑制细胞周期的进展。在甲状腺癌中，已有几种lncrna (MALAT1、H19、BANCR、HOTAIR)被鉴定为促进肿瘤发展的因子，可以作为早期诊断甚至治疗的新生物标志物[38]。据研究，与正常甲状腺组织相比，甲状腺癌组织和甲状腺癌细胞中MALAT-1的水平更高，IQGAP1的表达更高，lncRNA MALAT1在甲状腺癌中表达上调，可能通过调节IQGAP1的表达促进甲状腺癌细胞的增殖和侵袭[38]。LncRNA-MALAT-1通过调节肿瘤相关的巨噬细胞FGF2蛋白分泌促进甲状腺癌的血管生成[39]。Lin Liu[40]等人报道lncRNA H19在甲状腺癌组织和细胞中过表达，过表达的H19促进癌细胞生长，迁移，H19与miR-17-5p竞争性结合，而充当竞争性内源RNA(ceRNA)，H19拮抗miR-17-5p上调其靶标YES1的功能，并抑制miR-17-5p诱导的细胞周期进程。据研究[41]，HOXD-AS1在甲状腺乳头状癌组织和细胞系中过表达。HOXD-AS1的高表达与老年人，临床晚期，肿瘤大，淋巴结转移和远处转移有关，得出结论HOXD-AS1是预测甲状腺乳头状癌临床进展的生物标志物。Zhou[42]等人证实，与结节性甲状腺肿相比，PTC患者的肿瘤组织和血浆样品中的lncRNA CASC2表达显着下调。lncRNA CASC2在有淋巴结转移(LNM)的PTC患者的血浆中表达降低，并被认为是LNM患者的独立风险。此外，功能分析表明lncRNA CASC2的过表达抑制了PTC的细胞增殖，迁移和侵袭。lncRNA RGMB-AS1在PTC组织和细胞中表达上调，高度表达的lncRNA RGMB-AS1促进PTC的增殖，侵袭和迁移[43]。甲状腺癌肿瘤组织中的DARS-AS1水平明显升高，与甲状腺癌的病理分期，远处转移及预后不良有关，此外，甲状腺癌组织中microRNA-129和DARS-AS1水平呈负相关。DARS-AS1可以通过调节microRNA-129来促进甲状腺癌细胞的增殖和迁移能力[44]。通过已建立的miRNA-RNA数据和超几何学测试，证实了LncRNA-mRNA的相互作用。通过将差异表达的基因与RNA-RNA网络整合在一起，构建了PTC相关的lncRNA-miRNA-mRN网络。研究发现lncRNA RP11-159F24.1在PTC中上调，其目标miR-485下调，两者在PTC患者中表达模式呈负相关，表明RP11-159F24.1/miR-485/mRNA轴可能在PTC的开发中起重要作用[45]。研究表明，miR592的过表达抑制甲状腺癌的细胞增殖，迁移和侵袭，神经肿瘤腹侧抗原1(NOVA1)被发现为甲状腺癌细胞中miR592的新型靶基因，lncRNA NEAT1被认为在甲状腺癌细胞中充当miR592的海绵，从而调节NOVA1的表达。

2.3 circRNA与甲状腺癌

环状RNA(circRNA)是一类新型的RNA，具有更高的稳定性和组织特异性，可能作为新型临床标志物具有价值。

已有研究发现一些失调的circRNA与BRAFV600E突变，肿瘤包膜浸润，肿瘤PT分期和淋巴结转移有关，表明circRNA可能参与肿瘤的发生和癌症的发展，它们可能是诊断和评估的PTC的进展的生物标志物[46]。Shi Erlan[47]等人通过PCR检测113例PTC患者、80例甲状腺良性结节和111例健康对照者血清环状circRNA表达谱，结果显示，与健康对照组和甲状腺良性结节组相比，PTC患者中circRAPGEF5和hsa_circ_0058124两种circRNA表达显著上调，并且在识别PTC患者方面，联合circRNA优于单独的circRNA。通过实验研究发现[48]，甲状腺癌组织和细胞系中的hsa_circ_0102272显着升高；与hsa_circ_0102272低表达的患者相比，hsa_circ_0102272高表达的患者显示出显着较短的总生存期和无进展生存期。最新研究发现，CircTP53是在甲状腺癌组织中高表达的circRNA，高表达的circTP53通过靶向miR-1233-3p / MDM2轴降低了p53蛋白水平，并促进癌细胞的增殖[49]。Xia F[50]等人研究表明，Hsa_circ_0011385在甲状腺癌中表达上调，Hsa_circ_0011385通过靶向miR-361-3p促进了甲状腺癌细胞的增殖，侵袭和迁移，并抑制了甲状腺癌细胞的周期阻滞和凋亡。Wu G[51]等人通过RT-PCR检测circFNDC3B在PTC组织和PTC细胞系中的表达，用抗circFNDC3B的小干扰RNA(siRNA)稳定转染PTC细胞，并在细胞实验中检测细胞增殖，迁移和侵袭，同时在裸鼠中检测肿瘤发生。在这项研究中，研究者观察到circFNDC3B在PTC组织和细胞系中被上调，并且还证明了PTC患者的血清外泌体中circFNDC3B上调。近年来对于circRNA的研究取得进展的主要有：CircRNA_102171[52]、CircNEK6[53]、circBACH2[54]、circNUP214[55]、Circ_0067934[56]、circRAPGEF5[57]等因子在甲状腺癌中表达上调；Hsa_circ_0058124[58]等因子促进PTC细胞增殖、侵袭和转移。

3 小结

近年来甲状腺结节及甲状腺癌的发病率较以往有了明显的增长，其中大部分结节为良性结节，小部分为恶性结节，因此，鉴别其良恶性对临床医生和患者来说有着重要意义。目前，通过临床触诊、超声、核素显像及FNAB等方法综合评价，在一定程度上可以提高诊断的准确性，但仍有一部分不能明确诊断。近年来，随着分子遗传学的研究的不断深入和发展，为甲状腺癌的精确诊断及预后判断提供了大量的理论依据。对甲状腺癌的诊断和治疗也从经验医学层面逐步发展到询证医学到当今的精准医学层面，一些分子标志物的应用显著提高了对甲状腺结节性质的诊断准确性，避免了诊断性甲状腺手术的发生，并对预后的判断也有一定的意义。分子标志物的应用在甲状腺癌的诊断和预后评估上将发挥越来越重要的意义。

4 展望

目前对于甲状腺癌相关分子标志物的研究虽然比较广泛，但不同研究者对于研究的结果和结论仍然存在一定争议，且目前对于分子标志物在甲状腺癌中的作用机制尚未完全明确和被广泛认可，临床上对于甲状腺癌分子标志物的应用并不广泛，缺乏理论和技术支持，所以今后在甲状腺癌分子标志物方面的研究仍有很大的研究空间及必要性。肿瘤的发生是一个多因素的结果，可能存在多种基因或分子的异常表达，单一的分子标志物对甲状腺癌的诊断存在一定的局限性。今后的在甲状腺癌分子标志物的研究方面可发展多种基因或分子联合检测的方法，或可大幅度提高甲状腺癌的诊断率，同时应该着重发展在临床工作中高灵敏性、高特异性、低成本-高收益并操作简单的生物学标志物。希望随着研究的不但进展，生物学标志物在甲状腺癌的诊断、预后和治疗上发挥越来越显著的作用。