紧密连接在血脑屏障中的研究进展

王明明，唐瑞天，万群，徐丽丽，刘建雄*

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州；2.甘肃省人民医院神经外科，甘肃 兰州)

0 引言

BBB 是脑部重要的结构之一，对大脑起到屏障的作用，其组成较为复杂。各种因素都可对其调控，其中紧密连接更为重要。1963 年Farquhar 等首次通过电子显微镜发现了紧密连接(tight junctionTJ)。位于相邻内皮细胞质膜间的TJ 可延伸至内皮细胞间隙，为细胞旁扩散创造一种代谢和物理屏障，在维持血脑屏障完整性和通透性方面发挥着重要作用。其可限制血液和大脑之间的物质运动，以维持脑内微循环的平衡。正常生理条件下，TJ 是一种大型的、具有高度动态性的复合物，由跨膜蛋白Occludin 和Claudins、细胞质蛋白(zona occluden ZO)、连接粘附分子(Junctional adhesive molecule JAM)和细胞骨架蛋白等组成[1]。TJ 是高度专门化的，具有复杂的分子结构，可以决定细胞极性。其组成蛋白复合物在细胞内外因子的严格调控下，不断发生重构和变化改变它的生物特性，从而改变血脑屏障的通透性[2]。

1 紧密连接的组成

1.1 Occludin

Occludin 是第一个被鉴定的完整TJ 蛋白，具有60 kDa四聚体膜拓扑结构，其基因定位到染色体带5q.13.1，该蛋白是一种完整的膜蛋白，其含有四个与连接蛋白相当的疏水结构域，连接蛋白是位于间隙连接处的完整膜蛋白；氨基酸序列为四个跨膜区段，两个含有44 个氨基酸的细胞外环和两个细胞内结构域[3]。第一个细胞外环的氨基酸序列高度浓缩，含有丰富的酪氨酸和甘氨酸残基(约占60%)，第二个细胞外环对TJ 有特异性的调节功能，是细胞间形成TJ 的主要部位。胞质结构域和两个细胞外环在Occludin 定位中起关键作用。通过对Occludin 结构的研究表明，Occludin 的NH2-末端有4 个结构域，将蛋白分为5 个独立的结构域[4]。COOH-末端结构域由约250 个氨基酸残基组成，位于细胞质中。带电荷的氨基酸在COOH-末端胞质结构域中高度富集，COOH-末端融合蛋白特异性的与ZO-1、ZO-2 和许多其他外周膜蛋白的复合物相结合。当Occludin C 端截短可导致其与ZO-1 的相互作用丧失，阻止其组装成TJ[5]。

1.2 Claudins

随着对Occludin 功能认识的研究，另外两个完整的TJ 蛋白被发现。Furuse[6]等发现了Claudin-1 和Claudin-2。进一步得出，Claudins 与Occludin 结构相似，Claudins 有4 个跨膜结构域和2 个细胞外环，但它们与Occludin 的序列无相似性。Claudins 家族前两者的发现标志着TJ 研究的一个里程碑，其分子量大小约22～27 kDa，该膜蛋白家族有24 个成员，并揭示了Occludin 不是唯一位于紧密连接处的完整膜蛋白。Claudin-1 和Claudin-2 在细胞接触部位高度集中[7]。当Occludin 与Claudin-1 共转染时，明显表达的蛋白在细胞接触区域聚合成良好的链网。表明Occludin 的修饰可能会基于Claudins 的表达特性，或需要Claudins 才能完全插入形成的TJ 中。

大脑内皮细胞也可表达Claudin-3 和Claudin-5[8]。Claudin-5通过顺式和反式同型二聚或异型二聚支持TJ 完整性，其缺失可导致BBB 破坏。Claudin-5 蛋白沿脑血管表达，提示Claudin-5与血脑屏障完整性密切相关，可作为血脑屏障功能状态正常和紊乱的敏感指标。Claudin-5 的缺乏可直接导致血脑屏障通透性和选择性的增加。Claudin-5 也参与TJ 的选择性渗透和细胞极化。迄今为止可证明claudin-3 和claudin-5 在BBB TJ 中的定位[9]。

1.3 细胞质蛋白(zonaoccluden ZO)

ZO 属于膜相关鸟苷酸激酶家族，有ZO-1、ZO-2、ZO-3三种构型，并且三者可组成ZO-1/ZO-2/ZO-3 复合体，其中ZO-1 是组成BBB 中最重要的一种[10]。ZO-1 是一种胞质膜相关的副蛋白，其相对分子质量约为220 kDa。ZO-1 包含三个结构域：PSD95、DlgA、ZO-1 同源域，一个SRC 同源性3 结构域和一个酵母鸟苷酸激酶同源域。ZO-1 是TJ 的主要衔接蛋白，一方面与Occludin 的C 端区域相互作用，对于TJ 中Occludin 的组装和维持至关重要；另一方面与肌动蛋白细胞骨架相互作用，形成细胞与细胞骨架之间的连接点[11]。

1.4 连接粘附分子(Junctional adhesive molecule JAM)

1998 年Martin-Padura 等发现了另一个糖基化的跨膜蛋白：连接黏附分子，它属于免疫球蛋白家族，由胞外的两个免疫球蛋白样区域、一个跨膜区域、胞浆区的一个C 端区域组成，可分为JAM-1、JAM-2、JAM-3 和ESAM 四种[12]。其中JAM-1 与BBB 内皮细胞之间TJ 有密切关系，JAM-1 分子量大约40kDa，由一个跨膜区域，2 个免疫球蛋白样环状结构形成细胞外区域[13]。JAM-1 是跨膜蛋白中介导细胞与细胞之间互相结合的一类分子，其表达可直接影响紧密连接功能[14]。有研究表明用微波辐射大鼠血脑屏障，检测脑组织JAM-1 的表达量，结果显示其表达量减少，表明JAM-1 有可能参与微波辐射致BBB 通透性增高的病理过程[15]。JAM 与ZO-1 共沉淀中，说明JAM 可能通过ZO-1 间接介导Occludin 向TJ募集。

1.5 细胞骨架蛋白

肌动蛋白为细胞骨架的主要成分，此蛋白是细胞中一种分子量为中等大小的重要蛋白。由375 个氨基酸残基组成，是一个较大的、极其高度保守的基因编码。多个肌动蛋白形成多聚体，亦称肌动蛋白丝，称为纤维状肌动蛋白(fibrosactin F-actin)[16]。有学者通过缺氧的环境刺激内皮细胞的实验中发现骨架蛋白F-actin 的结构发生了变化。结果表明缺氧导致BBB 通透性改变可能与F-actin 结构发生重排有关，而与F-actin 的表达量无关[17]。有研究表明通过氧糖剥夺预处理大鼠脑微血管内皮细胞间TJ，可诱导缺血耐受产生，降低内皮细胞的损伤，使细胞间ZO-1 和F-actin 的膜定位发生改变，最终对脑微血管内皮细胞的损伤起保护作用[18]。

肌动蛋白共沉积研究示，Occludin 以及ZO-2、ZO-3 在体外均与F-actin 直接相互作用，表明肌动蛋白在TJ 处参与了多种相互作用。然而actin-TJ 复合物相互作用更全面的表明，Occludin、ZO-2 和ZO-3 不结合F-actin 末端，可能与F-actin 细丝侧结合蛋白连接[19]。在Occludin 的COOH 端细胞质域中也发现了F-actin 结合活性，而连接蛋白和F-actin之间的特定相互作用的功能还未被很好地理解。

2 紧密连接的作用

2.1 Occludin 的磷酸化与去磷酸化

Farshori 等通过诱导TJ 的开放和再封闭，研究了融合MDCK 细胞单层中Occludin 的磷酸化。TJ 通透性和蛋白激酶C-a 易位的增加与Occludin 磷酸化的可逆增加一致[20]。这说明蛋白激酶C-a 通过调节Occludin 磷酸化来调节TJ 屏障效能。Sontag[21]等人研究了蛋白磷酸酶2A (PP2A) 在TJ调控中的作用，PP2A 是重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。TJ 区PP2A 的增加导致Occludin 去磷酸化，同时降低跨上皮电阻，并阻止TJ 的发生：也提出PP2A 可能直接靶向并调控aPKC/Par-3 信号复合物，而aPKC/Par-3 信号复合物在调节TJ 组装和屏障功能方面发挥作用。该研究中Occludin 去磷酸化表明Occludin 是上皮细胞中PP2A/aPKC 信号转导的靶点。酪氨酸磷酸化与上皮细胞和内皮细胞TJ 通透性增加也有关。

Occludin 细胞内C 端尾部酪氨酸磷酸化水平被认为是决定其与ZO-1、ZO-2、ZO-3 等TJ 蛋白结合能力的关键[22]。结果表明酪氨酸磷酸化的Occludin 结合ZO-1、ZO-2、ZO-3蛋白的数量比非磷酸化的Occludin 高数倍。可认为氧化应激刺激的酪氨酸磷酸化可能改变TJ 复合物，结果示氧化应激诱导Occludin 和ZO-1 酪氨酸磷酸化，并通过酪氨酸激酶依赖机制将Occludin-ZO-1 复合物从TJ 和细胞骨架部分解离[23]。Occludin 和ZO-1 的酪氨酸磷酸化提示酪氨酸磷酸化可能介导TJ 对Occludin-ZO-1 复合物的破坏和重新定位，从而导致细胞旁通透性增加

2.2 Occludin 与GTPases 的关系

Occludin 功能磷酸化阶段也受小GTPases 的影响。小GTPases 是一类gtp 结合蛋白，调控多种细胞内过程，包括调节TJ 通透性。该家族中有100 多个蛋白。根据结构和功能，将Ras 超家族分为五个主要的亚家族：Ras、Rho、Rab、Arf和Rab。Ras 超家族的几个成员已被证明可以调节Occludin的结构和功能。Jou[24]等研究了Ras 相关的小gtp 结合蛋白RhoA 和Rac1 在TJ 结构和功能组织中的作用。

本构型活性RhoA 和Rac1 突变体对Occludin 的分布产生了较大的破坏，这说明RhoA 和Rac1 在调节Occludin 功能中发挥作用。Ras 及其驱动的细胞内通路可能是TJ 功能的调节因子，特别是Raf1 被认为是Ras 的主要的中下游效应因子。Li 和Mrsny[25]证明Occludin 受致瘤因子Raf1 下调，与TJ 完整性的缺失有关。

当ATP 耗尽后，Occludin 中磷酸化氨基酸水平加速下降。此外，Occludin 中丝氨酸/苏氨酸磷酸化的调控与Rho GTPase 突变体的表达一致，这表明Rho 信号调控Occludin 活性。从本质上讲，Rho 信号活性的提高保护了TJ 免受ATP 耗尽所带来的有害影响[26]。Rho 的关键下游靶点p160 ROCK/Rho 激酶已被证实是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，与调控肌动蛋白组织有关。结果示Occludin 的磷酸化受到RhoA-p160 ROCK 依赖和独立途径的调控。这表明Occludin 磷酸化可能独立于细胞骨架介导TJ 改变，而Occludin 是调控其磷酸化受体刺激信号通路的靶点[27]。

Rho 调控TJ 的另一种模式可能涉及直接修饰连接膜蛋白。当本构型活性形式的RhoA 在MDCK 细胞中过表达时，Occludin 磷酸化水平升高，表明Rho 信号可以直接影响TJ 蛋白。当Rho 受到内皮细胞中LPA 或组胺刺激时，Occludin 羧基端磷酸化增加，这被认为是调节Occludin 与连接肌动蛋白细胞骨架的相互作用，从而调节细胞旁通透性。

2.3 其他蛋白

Zuoet[28]等认为糖原合成酶激酶3 β (GSK-3 β)可能影响Claudins 的表达，Lengfeld[29]等人的研究表明，Wnt/β-catenin信号通路通过增加Claudins 表达，控制BBB 的发育，增强BBB 表型，通过抑制GSK-3β 激活Wnt/β-catenin 信号通路可以增加β-catenin、Claudin-3 和ZO-1 的表达，从而减弱BBB的破坏。Taddei[30]等人报道，PI3K/Akt 活化可以限β-catenin向细胞核的易位，最终增加了Claudin-5 的表达。研究也表明，PI3K/Akt 的 激 活 可 以 通 过GSK-3β 和β-catenin 提 高Claudin-3 和Claudin-5 的表达。

ZO 是沿细胞膜连续分布的细胞间TJ 复合物的重要结构蛋白，与Occludin 和Claudins 相互作用，将TJ 锚定在内皮细胞骨架和肌动蛋白上[31]。ZO-1 不是特异性的TJ 标志物，但是TJ 的重要调控因子，在维持细胞极性、细胞骨架形成、TJ 定位、细胞旁屏障等方面发挥重要作用，ZO-1 与BBB渗透率也密切相关。ZO 蛋白对于紧密连接处的Claudins 和Occludin 的组装至关重要，从而将它们锚定在肌动蛋白细胞骨架上。JAM 具有细胞与细胞间的粘附作用，也参与TJ 渗透性的调控和调节白细胞的迁移。肌动蛋白细胞骨架的调控及其与TJ 组分的相互作用在上皮屏障特性的调控中起着重要的锚定作用。提供了连接的稳定性，以及在连接重塑和细胞形状变化过程中起到传递力的连接器。

3 展望

BBB 具有重要的屏障功能，对维持中枢系统的内环境起到非常关键的作用，而TJ 的开放与关闭调控着BBB 的功能。目前人们对紧密连接的组成，结构以及功能的认识还不够充足。今后随着人们对血脑屏障研究的不断认识，对TJ 各种组成以及功能的不断了解，认识到BBB 的变化以及TJ 组成的异常都会出现各种疾病。虽然各种成像技术，分子生物学技术相对比较成熟，但是对TJ 蛋白之间互相协调、互相影响机制的认识仍不足。在以后通过多学科合作，各种先进技术的不断发展，人们对新知识的不断探索，会对BBB-TJ 更有深刻的认识，提前做到对疾病的预防，以及新药物更能容易透过BBB，对治疗疾病找到最新的、可靠的作用靶点。