锌指转录因子家族调控血管内膜增生的研究进展

高昆，刘红霞，何朝勇,2

1中国药科大学，南京210009；2天然药物活性组分与药效国家重点实验室

血管成形术可重塑血管管腔、恢复受斑块阻塞>血管内的血流通过、改善低灌注组织或器官内的氧气物质供应，是临床治疗动粥斑块积累的常规方法[1]。然而，由于手术导致的血管损伤或血流动力学改变会引起血管内膜增殖，导致血管二次狭窄，严重影响了血管成形术的治疗效果和患者预后。研究数据显示，冠脉植入裸露支架后1～3年内发生再狭窄的概率为30.6%。药物洗脱支架尽管可降低再狭窄率，但这类药物抑制了内皮细胞(ECs)的增殖和修复能力，导致术后晚期管腔丢失速度加快[2,3]。因此避免血管新生内膜形成所导致的血管二次狭窄，对提高血管介入疗法的治疗效果具有重要意义。目前对于新生内膜的形成机制尚不完全明确，通常认为该过程可分为以下三个阶段：①多种因素引起血管血流动力学改变或血管内皮损伤，致使ECs维持的血管稳态失衡；②免疫细胞和血小板浸润到损伤部位并释放IL-8、PDGF等细胞因子；③异常升高的细胞因子激活位于血管中膜的血管平滑肌细胞(VSMCs)，VSMCs在多种基质金属蛋白酶(MMPs)的帮助下穿越内弹性膜到内膜下，大量增殖并分泌细胞外基质(ECM)，使得血管内膜增厚[4,5]。KLFs家族是体内广泛分布的一类转录因子，在ECs、VSCMs、免疫细胞等部位中具有重要的生物调节功能，新生内膜形成过程中存在多种KLFs因子的表达变化。现就KLFs在血管内膜增生中的作用阐述如下。

1 KLFs的结构与功能

KLFs家族是一类结构高度保守的转录因子，因结构与转录因子SP1相似，故又被称为SP/KLF家族。该家族每个成员的羧基端都有三个高度保守的Cys2 /His2锌指结构域，每个锌指结构都能与靶基因的启动子或增强子上的5′-GACCC-3保守序列结合，调控相应基因的表达[6]。此外，有研究表明，KLFs的Cys2 /His2锌指结构域还能与核输入因子β或β样核输入因子结合调控KLFs由胞质向核内的转位[7]。尽管KLFs家族成员在结构上高度保守，所识别的DNA序列亦存在一定程度重叠，但不同的KLFs对同一基因却拥有不同的转录调控作用。这主要是由于某些KLFs蛋白的氨基端具有转录激活区域和转录抑制区域，能与转录辅激活物、转录辅阻遏物相结合调控KLFs的转录活性，如KLF3、KLF8、KLF12的氨基端存在CtBP蛋白结合位点，KLF10、KLF11等的氨基端具有Sin3蛋白结合位点，这些位点能与转录辅阻遏物CtBP或者Sin3蛋白结合，使KLFs由转录激活因子转变成抑制因子。这种调控方式使得不同KLFs之间存在相互调节、竞争、协同的作用，KLFs在细胞内的生物学功能也因此变得更加多样和复杂。

2 KLFs对血管内皮功能的调节

ECs是构成血管内膜的重要成分，在正常生理状态下，分泌NO及多种细胞因子调控血管张力、血管生长和凝血等生理功能。当血流状态改变或外力引起内皮损伤后，ECs对中膜VSMCs的保护和调控遭到破坏，导致VSMCs暴露于炎症因子和生长因子，引起VSMCs过度增殖和迁移形成新生内膜。部分在内皮细胞中高表达的KLFs如KLF2、KLF4、KLF6和KLF11可通过调节ECs中eNOS、IL-6、黏附分子的表达等途径参与调节血管内膜稳态[8,9]，并借此参与新生内膜的形成过程。

2.1 KLF2和KLF4与血流动力学变化 ECs是血管中直接与流动的血液相接触的细胞，其细胞膜上的机械力感受器能够感知血流变化，并通过复杂的机械力信号传导通路将机械信号传递到核内，调节ECs内的氧化应激、细胞排列、脂蛋白渗透与氧化等过程。通常认为高剪切力的单向层流(UF)具有保护ECs的作用，而低剪切力的湍流(DF)则会诱导ECs表达VCAM-1、E-selectin、MCP-1招募免疫细胞或释放炎症因子IL-6等激活中膜VSMCs。研究发现，当某些外界因素引起血流由UF变为低剪切力湍流DF时，ECs中的一些机械力敏感型转录因子如KLF2、KLF4会出现明显的表达降低。研究发现，KLF2能调控血流动力敏感蛋白PPAP2B的表达，介导层流下ECs的排列和抗炎作用[10]。CD39是ECs膜上一种具有动脉粥样硬化(AS)保护作用的蛋白，层流诱导的KLF2能在转录水平与CD39基因的启动子结合增加CD39表达，减少ApoE-/-小鼠的AS斑块形成[8]。此外，转录组学研究显示，在内皮细胞中敲除KLF2和KLF4会损伤ECs内氧化应激、炎症反应、凝血等过程[9]。上述结果提示，在血管静脉瘘、静脉旁路移植手术等引起血流状态变化时，KLFs可能通过参与调节ECs对血流状态变化的应答参与新生内膜形成。

2.2 KLF6与血管内皮损伤修复 KLFs抑制内皮细胞损伤后的修复亦可能是其参与调节新生内膜的形成的方式之一。研究发现，转录因子KLF6能与MMP14的启动子结合，在转录水平增加MMP14的表达，而MMP14会通过水解内皮糖蛋白释放可溶性内皮糖蛋白影响TGF-β信号通路，从而影响血管损伤后内皮细胞修复[11]。另外，有研究发现KLF6还可与SP1、Smad3组成三元复合物，该复合物能与Ⅰ型TGF-β受体ALK-1的启动子结合促进ALK-1的表达，从而影响TGF-β信号通路，间接参与TGF-β信号通路介导的ECs损伤后修复过程[12]。

3 KLFs 对炎症反应的调控

内皮损伤后，ECs招募白细胞在损伤局部浸润，并释放炎症因子是引起VSMCs激活的重要原因之一。KLFs能通过多种途径参与对ECs内炎症反应及免疫细胞招募的调控。在ECs中过表达转录因子家族中的KLF2和KLF4能促进ECs中eNOS和血栓调节素的表达，使ECs呈现出一种抗炎表型[8]。Yoshida等[13]发现，应用Tie-Cre在内皮细胞和造血细胞中特异性敲除KLF4能加重血管损伤后新生内膜形成。KLF4能通过抑制NF-κB与黏附分子VCAM-1启动子的结合，减少ECs表达VCAM-1，从而抑制血管损伤后的免疫细胞浸润。KLF2亦会以类似的方式抑制ECs细胞膜表面VCAM-1、E-selectin的表达，影响ECs招募中性粒细胞、巨噬细胞等免疫细胞。此外，KLF11似乎能以负反馈的方式调节ECs炎症反应，用炎症因子TNF-α和LPS刺激ECs炎诱发炎症的同时也会增加ECs中KLF11的表达；而KLF11-/-小鼠表现出增强内皮细胞对白细胞的招募，诱发内皮炎症变化[14]。除直接调控ECs的炎症反应，KLFs也可能会通过调节单核细胞分化减轻血管损伤后的局部炎症反应。有报道发现，KLF4能促进巨噬细胞由M1型向M2型转化，在髓系细胞中敲除KLF4显示出加重AS斑块中的炎症反应[15]。

4 KLFs对VSMCs功能的调控

VSMCs是构成动脉血管中膜的主要细胞成分，通过调整自身的收缩与扩张控制着动脉的管径、血压、血流等特性。生理状态下的VSMCs表现出很低的增殖和迁移能力，分泌较少的ECM，在转录因子SRF和辅助转录因子myocardin的调控下表达与VSMCs收缩功能相关的蛋白，如SM-MHC、α-actin、Sm22α等[5]，这种状态下的VSMCs被称为收缩型VSMCs。当血管损伤或疾病使VSMCs暴露于Ox-LDL、炎症因子、生长因子等刺激下，其会通过表型转换成为具有更高增殖和迁移能力和分泌大量ECM的合成表型细胞，同时减少表达收缩功能蛋白[16]。这种代谢旺盛的合成表型VSMCs是构建新生内膜的关键，因此调控血管损伤后VSMCs的异常活动对新生内膜形成具有重要意义。

4.1 KLFs与VSMCs表型转换 KLF4通常主要表达在胃肠上皮组织中，在完整血管的VSMCs中表达量很低，但在血管受到损伤后的短期内，VSMCs内KLF4的mRNA和蛋白水平能快速升高。PDGF是一种经典的诱导VSMCs增殖、减少收缩marker基因表达的生长因子。Liu等[17]发现，VSMCs中KLF4的mRNA会在PDGF作用45 min后达到最高值，用siRNA沉默KLF4能部分抑制PDGF诱导的VSMCs收缩Marker基因表达。Laura等[18]用谱系追踪技术分析AS斑块中平滑肌细胞样细胞(SLC)的来源，结果显示VSMCs中特异性敲除KLF4能抑制VSMCs表型转换并提升AS斑块及纤维帽中SLC的含量。研究显示，KLF4能通过多种途径参与调控VSMCs表型转换过程。一方面KLF4能直接与SM-MHC、α-actin、Sm22α等VSMCs收缩表型的Marker基因启动子区域的G/C抑制元件结合，抑制VSMCs收缩功能相关基因的表达。另一方面，KLF4能通过抑制SRF与SM-MHC、α-actin、Sm22α等基因启动子区域的CArG元件结合，或抑制辅助转录因子myocardin的表达，间接性地调控VSMCs收缩型的marker基因[19]。KLF4还是骨形成蛋白-2,-4,-6和TGF-β1的下游分子，后者通过诱导miRNA-143/145表达减少KLF4的mRNA水平，维持VSMCs的收缩表型[20]。此外，与KLF4的作用相似，VSMCs中KLF5和KLF15的含量也在血管损伤后增加，主要表现出促VSMCs增殖和表型转换作用。KLF5和KLF8能通过抑制α-SMA和Sm22α的启动子活性，间接性地阻断血管紧张素Ⅱ引起的VSMCs收缩[21]。

4.2 KLFs与VSMCs增殖 KLF4是抑制细胞周期进程的重要转录因子，在肠道黏膜组织中或细胞受到辐射损伤后，KLF4能促进细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p53与p21的启动子结合，通过提高p21的表达阻断细胞周期进程，抑制细胞增殖。Yoshida等[22]发现，在VSMCs中KLF4亦通过相似的方式抑制内皮损伤后VSMCs增殖，加重血管损伤后新生内膜的形成。此外，有研究提出KLF4诱导p21表达的作用能被小泛素化修饰逆转。用PDGF在诱导VSMCs表型转换和KLF4表达的同时，还能促进KLF4与小泛素化修饰中的关键酶Ubc9结合，促进KLF4的小泛素化修饰过程。小泛素化KLF4招募部分辅阻遏物如NCoR和HDAC2到p21的启动子，抑制p21的转录，表现出促进VSMCs增殖的作用[23]。与KL4相似，KLF5亦主要以p21依赖的方式参与调控VSMCs增殖。KLF5可以通过抑制p21的表达阻断血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的细胞周期进程。另外，Ang Ⅱ可通过ERK-MAPK通路激活KLF5的表达，同时促进KLF5与c-Jun结合增加细胞周期蛋白Cyclin D1的表达，最终引起VSMCs的增殖。在非VSMCs细胞中，亦有研究发现KLF6、KLF8能与Cyclin D1的启动子结合促进细胞周期。这些KLFs可能以相同方式调控VSMCs的增殖，参与新生内膜的形成，不过此有待在动物体内和VSMCs上进行验证。

5 未来研究展望

目前,针对血管内膜增生尚无有效的预防和治疗办法，在临床中常采用药物洗脱支架缓解血管植入支架后的二次狭窄，但仍不能完全解决这一问题。有报道发现miRNA家族多个成员如miRNA143/145能通过抑制KLF4的表达抑制新生内膜，同时部分小分子化合物如ATRA能抑制KLF4在Sm22α启动子上的结合抑制VSMCs表型转换和增殖。这些研究均提示以KLFs为靶点治疗新生内膜的潜在可行性。然而，KLFs家族成员在在不同组织和细胞中表达的种类和功能都不尽相同，在新生内膜形成过程中，同一KLF在ECs和VSMCs中可能发挥完全相反的效果，如KLF4能维持ECs的抗炎表型，而在血管损伤后的VSMCs中促进VSMCs表型转换。在开发以单个KLFs为治疗新生内膜的靶点时，应该注意KLFs生物学功能的组织特异性。此外，当前对KLFs家族在新生内膜中的生物功能还缺乏系统性地认识，除本文涉及的主要几种KLFs外，KLFs家族其他成员在内膜增生中的作用还尚不明确，有报道发现不同KLFs之间存在相互竞争或协同作用，此可能会削弱以单个KLF为治疗靶点的治疗效果。KLFs家族在新生内膜中的作用还需进一步研究和揭示，这将更有助于开发以KLFs或KLFs相关信号通路为靶点的治疗策略。